脅迫生長條件下副溶血性弧菌的生物特性分析

高 璐，歐陽敏，張 輝，饒勝其，尹永祺，楊振泉,3,*，沈明君

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省人獸共患病重點實驗室，江蘇 揚州 225127；4.揚州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司，江蘇 揚州 225000)

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是海洋動物中常見的病原菌，也是夏秋季沿海地區(qū)引發(fā)人類微生物性食物中毒的重要病原菌[1-3]。副溶血性弧菌是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，具有嗜鹽性，最適生長pH值為7.4～8.0，最適鹽度為2～4 g/100 mL NaCl，最適生長溫度為37 ℃，在夏季水溫24～32 ℃條件下最易生長繁殖，對酸敏感。

在水產(chǎn)品的加工儲藏過程中，加熱、冷藏、低鹽、干燥、高滲透壓、酸處理、發(fā)酵、抗菌藥物等處理方法常使食源性致病菌處于脅迫應(yīng)激環(huán)境，研究表明大多數(shù)細菌能對這些物理和化學脅迫因素作出迅速的應(yīng)激響應(yīng)，使其在不良環(huán)境下維持生存，并且保持一定的代謝活性和致病能力，一旦環(huán)境適宜其生長，會迅速修復(fù)并且繁殖，因此會造成食品的安全隱患[4-5]。

以副溶血性弧菌為研究對象，研究其分別在低鹽度、低pH值和高溫的應(yīng)激條件下脅迫生長狀態(tài)、細胞形態(tài)、生物被膜生成能力、溶血素活力和外膜蛋白酶產(chǎn)生情況，旨在探究環(huán)境因素對副溶血性弧菌造成的應(yīng)激反應(yīng)，為副溶血性弧菌對環(huán)境脅迫響應(yīng)機制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料，同時可以為水產(chǎn)品的加工貯藏條件、加強安全預(yù)防措施提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CICC21617） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS）培養(yǎng)基、氯化鈉堿性蛋白胨水（alkaline peptone water，APW）培養(yǎng)基杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7504C分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；Heraeus PICO17型臺式離心機 美國Thermo公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tommy公司；DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；ZHJH-C1209B型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司；M200多功能酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)

將凍干保藏的副溶血性弧菌標準菌株用3% APW（pH 8.5）稀釋，吸取200 μL菌液接種于10 mL APW培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)過夜；接種環(huán)蘸取傳代培養(yǎng)的菌液于TCBS平板劃線分離；挑取綠色、光滑的典型副溶血性弧菌菌落，接種于APW培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min搖床過夜培養(yǎng)；吸取菌液于1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清液，用滅菌生理鹽水重懸，調(diào)整菌液OD600nm值至0.6，制得菌懸液備用。

1.3.2 副溶血性弧菌脅迫條件的確定

1.3.2.1 低鹽度、低pH值脅迫條件的確定

分別配制0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/100 mL NaCl的APW作為低鹽度的脅迫培養(yǎng)基；用檸檬酸調(diào)整APW的pH值分別至6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5作為低pH值脅迫培養(yǎng)基。

吸取100 μL菌懸液，分別接種于10 mL各脅迫培養(yǎng)基中，每個條件設(shè)置3 個平行樣，37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h；分別選取菌液出現(xiàn)渾濁（OD600nm＞0.3）的最低NaCl質(zhì)量濃度和最低pH值作為相應(yīng)脅迫條件。

1.3.2.2 高溫脅迫條件的確定

吸取1 mL菌懸液于1.5 mL離心管中，分別于45、50、55、60、65 ℃水浴5min后；吸取100 μL菌懸液接種于pH 7.0、3.0 g/100 mL NaCl的APW培養(yǎng)基中，每個pH值設(shè)置3 個平行，37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h；選擇菌液出現(xiàn)渾濁（OD600nm＞0.3）的最高溫度作為高溫脅迫條件。

1.3.3 副溶血性弧菌脅迫株的培養(yǎng)

按照1.3.2節(jié)中確定的脅迫條件參考相應(yīng)方法反復(fù)傳代培養(yǎng)10 次后進行各脅迫株生物特性指標的測定。

1.3.4 副溶血性弧菌脅迫株生物特性的測定

1.3.4.1 掃描電子顯微鏡對脅迫株的形態(tài)觀察[6]

吸取各脅迫株和原始株菌液1 mL，加入等體積5%的戊二醛溶液固定過夜；雙蒸水洗滌3 次，每次15 min；用50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液梯度脫水；乙酸乙酯和無水乙醇等比例混合作用30 min，離心棄上清液；乙酸乙酯作用30 min，離心棄上清液；沉淀重懸于乙酸乙酯溶液中，樣品加入點樣盤中，烘干；鍍膜，置電子顯微鏡下觀察。

1.3.4.2 生存能力的測定[7]

分別將低鹽度、低pH值、高溫處理的傳代株和原始株的菌液調(diào)至OD600nm值為0.6，吸取100 μL各傳代株和原始株分別接種于對應(yīng)脅迫條件的APW培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，稀釋涂布TCBS培養(yǎng)基計算活菌數(shù)。

1.3.4.3 生物被膜生成能力的測定[8]

將各脅迫株和原始株菌懸液接入APW培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD600nm值至0.8左右，向無菌96 孔板中加入菌液200 μL/孔，每組9 個平行，無菌APW為空白對照；25 ℃靜置培養(yǎng)3 d，隔天換液；吸出菌液，250 μL/孔滅菌生理鹽水清洗2 次；加入200 μL/孔0.1%結(jié)晶紫染色，靜置5 min后吸出液體，滅菌生理鹽水清洗3 次，60 ℃恒溫干燥10 min；加入200 μL/孔33%冰醋酸溶液，靜置10 min后用酶標儀測定OD630nm值。各菌株OD630nm值減去空白對照OD630nm值，定義OD630nm值增加0.001為1 個生物被膜生成活力單位（U）。

1.3.4.4 溶血素活力的測定[9]

將新鮮雞血與兩倍體積的Alsever溶液混合，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，棄上清液，再經(jīng)生理鹽水洗滌3 次后制得10%紅細胞懸液，備用；用相應(yīng)APW調(diào)整各脅迫株菌液OD600nm值至0.8，8 000 r/min離心5 min取上清液100 μL加入含100 μL/孔10%紅細胞懸液的96 孔板中，每組9 個平行，新鮮APW培養(yǎng)液加入紅細胞懸液作為空白對照，于37 ℃恒溫放置1 h后測OD540nm值。各脅迫菌株OD540nm值減去空白對照OD540nm值，定義OD540nm值減小0.001為1個溶血素活力單位（U）。

1.3.4.5 產(chǎn)胞外蛋白酶能力的測定[10]

將酪蛋白1.0 g、酵母浸出粉0.2 g、NaCl 3.5 g溶解于100 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至8.5，制成A液；將3 g瓊脂溶解于50 mL蒸餾水，制成B液；A液、B液滅菌后立即混合，搖勻后，傾注平板，制成酪蛋白平板；副溶血性弧菌各脅迫株和原始菌株菌液點種于酪蛋白平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，用盧戈氏碘液對培養(yǎng)基進行染色，測定透明水解圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。

1.3.4.6 外膜蛋白的提取[11]

將副溶血性弧菌各脅迫株與原始株菌懸液接入100 mL APW培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min搖床過夜培養(yǎng)后于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，沉淀用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）重懸，于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，重復(fù)2 次，沉淀用10 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）重懸；全菌經(jīng)超聲波破碎（工作3 s，間隔2 s）至菌液澄清透明后，4 ℃、6 000 r/min離心15 min；取上清液加入10 mL離心管中，4 ℃、18 000 r/min離心60 min，棄去上清液；沉淀用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含2 mmol/L EDTA）重懸，再加入兩倍體積的0.5% Sarkosyl溶液，靜置30 min后，4 ℃、20 000 r/min離心30 min；沉淀用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）重懸后，再于4 ℃、20 000 r/min離心30 min，棄去上清液，沉淀用10 mmol/L PBS（pH 7.4）重懸；使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，用10 mmol/L PBS（pH 7.4）將蛋白質(zhì)溶液稀釋至3 μg/μL；取蛋白溶液50 μL與相同體積上樣處理液混合，在沸水中水浴7 min后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析，2 h后結(jié)束，經(jīng)染色脫色后觀察條帶。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均為3 次平行測定的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 7.0軟件進行ANOVA單因素方差分析，繪圖采用Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌脅迫條件確定結(jié)果

副溶血性弧菌在pH值分別為6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的APW培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，能生長（OD600nm＞0.3）的最低pH值為5.0。

副溶血性弧菌分別在45、50、55、60、65 ℃的水浴鍋中水浴5 min后，加入pH 7.0、NaCl 3.0 g/100 mL的APW培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，能生長（OD600nm＞0.3）的最高溫度為50 ℃。

副溶血性弧菌分別在鹽度0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/100 mL NaCl的APW培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，能生長（OD600nm＞0.3）的最低鹽度為0.9 g/100 mL NaCl。

2.2 脅迫株的形態(tài)變化

副溶血性弧菌分別經(jīng)pH 5.0、50 ℃、0.9 g/100 mL NaCl各脅迫環(huán)境培養(yǎng)后進行掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果見圖1。與原始菌株相比，經(jīng)過應(yīng)激脅迫培養(yǎng)后的菌株顯微形態(tài)有了明顯變化，原始菌株的細胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的直桿或彎曲的短桿狀，大小均一（圖1A）；經(jīng)pH 5.0脅迫培養(yǎng)菌株細胞表面變的粗糙且有部分細胞膜破裂的現(xiàn)象（圖1B）；經(jīng)50 ℃脅迫培養(yǎng)菌體細胞破裂較pH 5.0脅迫培養(yǎng)菌株嚴重，細胞之間還可見絮狀物質(zhì)凝聚（圖1C）；經(jīng)0.9 g/100 mL NaCl脅迫培養(yǎng)菌株大部分從短桿變成了表面光滑、圓形的球體（圖1D）。結(jié)果表明，菌株在不同的應(yīng)激生存環(huán)境下細胞形態(tài)變化有所差異，這可能是由于其不同的響應(yīng)機制所致。

圖1 副溶血性弧菌各脅迫株的顯微結(jié)構(gòu)（×20 000）Fig. 1 Morphological characteristics of V. parahaemolyticus under different stresses (× 20 000)

2.3 脅迫株生存能力

將副溶血性弧菌各脅迫株與原始菌株分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)脅迫環(huán)境的APW培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，稀釋涂布TCBS平板，測定每毫升菌液菌落總數(shù)，結(jié)果見表1。各脅迫株的菌落總數(shù)明顯高于原始菌株，其中經(jīng)低鹽度、低pH值應(yīng)激培養(yǎng)后的脅迫菌株與原始菌株相比較，菌落總數(shù)差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)過高溫應(yīng)激的菌株與原始菌株相比較，菌落總數(shù)差異極顯著（P＜0.01）。表明副溶血性弧菌經(jīng)應(yīng)激適應(yīng)后應(yīng)對不利生存條件的能力有所增強。

表1 副溶血性弧菌各脅迫株的生存能力Table 1 Viabilities of stressed and control strains of V. parahaemolyticus

2.4 生物被膜生成能力

細菌生物被膜是細菌在生長過程中為了適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性物體后形成的一種特殊復(fù)合體，由細菌和自身分泌的多糖、蛋白質(zhì)等胞外基質(zhì)組成，是一個三維立體空間結(jié)構(gòu)的生態(tài)系[12-13]。各脅迫傳代株和原始菌株的生物被膜生成能力如圖2所示，各脅迫傳代株的生物被膜生成能力均有所提升，與原始菌株相比，差異極顯著（P＜0.01），其中低鹽傳代株的生物被膜生成能力最強。說明副溶血性弧菌在不利生存環(huán)境中可能是通過增強其生物被膜的生成來增強其生存能力的。

大量研究證實，幾乎所有的細菌都可形成生物被膜，被認為是導(dǎo)致食品加工環(huán)境中細菌持續(xù)存在的一個主要原因[14]。渠宏雁等[15]的研究發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌能形成穩(wěn)定且明顯的生物被膜，其生物被膜的形成受溫度、NaCl濃度、pH值等環(huán)境因子的影響。

圖2 副溶血性弧菌各脅迫株的生物被膜生成能力Fig. 2 Biofilm formation abilities of different stressed strains of V. parahaemolyticus

2.5 溶血素活力

溶血素是分布十分廣泛的毒力因子，存在于很多致病性弧菌中，可以裂解紅細胞膜而使血紅蛋白釋放，在細菌感染過程中不同類型的溶血素發(fā)揮著不同的作用[16-17]。從圖3可以看出，副溶血性弧菌在分別經(jīng)過0.9 g/100 mL NaCl、pH 5.0、50 ℃的脅迫傳代培養(yǎng)后，溶血素活性均有所降低，與原始菌株相比，差異極顯著（P＜0.01），其中經(jīng)過低pH值傳代培養(yǎng)后對副溶血性弧菌的溶血素活性影響最為顯著。說明不利環(huán)境尤其是低pH值會導(dǎo)致副溶血性弧菌的溶血素活力降低。

圖3 副溶血性弧菌各脅迫株的溶血素活力Fig. 3 Hemolysin activities of different stressed strains of V. parahaemolyticus

2.6 產(chǎn)胞外蛋白酶能力

胞外蛋白酶被認為是副溶血弧菌的致病相關(guān)因子，在致病過程中發(fā)揮著重要作用[18-19]。副溶血性弧菌在分別經(jīng)過0.9 g/100 mL NaCl、pH 5.0、50 ℃的應(yīng)激培養(yǎng)后的產(chǎn)胞外蛋白酶能力如圖4所示，與原始菌株相比，應(yīng)激菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的能力均有所降低，且差異顯著（P＜0.05），說明不利環(huán)境會導(dǎo)致副溶血性弧菌產(chǎn)蛋白酶的能力降低，可能會導(dǎo)致其毒力下降。

圖4 副溶血性弧菌各脅迫株產(chǎn)蛋白酶能力Fig. 4 Protease-producing abilities of different stress strains of V. parahaemolyticus

2.7 外膜蛋白生成情況

外膜蛋白位于細胞壁表層，是革蘭氏陰性菌特有的外膜主要結(jié)構(gòu)成分，在維持細菌細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細胞的物質(zhì)交換及細菌的致病過程中起著十分重要的作用[20]。

使用Sarkosyl法提取副溶血性弧菌各脅迫株外膜蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE后所得結(jié)果如圖5所示，與原始菌株相比，分別經(jīng)低鹽度、低pH值、高溫應(yīng)激培養(yǎng)菌株的外膜蛋白條帶有一定的差異，大分子質(zhì)量（＞60 kDa）的蛋白表達量和種類要高于原始菌株，低鹽度脅迫株尤為明顯。說明在極端條件（溫度、酸、鹽度等）下，某些外膜蛋白能進行特異表達以阻止一些特定物質(zhì)進入，從而維持細胞內(nèi)的滲透壓和穩(wěn)定性[21]。

圖5 副溶血性弧菌各脅迫株外膜蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE profiles of outer membrane proteins of different stressed strains of V. parahaemolyticus

3 結(jié) 論

有研究表明，不同的菌種，預(yù)適應(yīng)處理的差異、致死劑量的差異和生長階段的差異都會產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng)[22]。細菌的細胞結(jié)構(gòu)可能發(fā)生相應(yīng)變化以抵抗環(huán)境的脅迫，細菌細胞膜蛋白分子質(zhì)量發(fā)生相應(yīng)變化，細胞膜上不飽和脂肪酸含量升高以及細胞內(nèi)幾種抗氧化酶活力升高等，細菌可以通過一系列生理反應(yīng)以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，從而提高對逆境的耐受性[23-24]。

本實驗將副溶血性弧菌菌株分別經(jīng)0.9 g/100 mL NaCl、pH 5.0、50 ℃應(yīng)激脅迫傳代培養(yǎng)后，與原始菌株相比，脅迫菌株的細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化、生存能力和生物被膜的形成能力顯著增強、溶血素活力和產(chǎn)蛋白酶能力顯著降低、分泌的外膜蛋白種類也有所增加，說明副溶血性弧菌可以通過改變自身生物學特性來適應(yīng)外界的不利生存環(huán)境。

目前的研究認為，副溶血性弧菌多存在于海產(chǎn)品中，并且其對酸和熱的抵抗能力較弱，在食醋中浸泡3 min或55 ℃保持5 min便可以殺滅副溶血性弧菌。研究結(jié)果表明，副溶血性弧菌可以逐漸適應(yīng)低鹽度的環(huán)境，因此解釋了淡水中大量檢出副溶血性弧菌的現(xiàn)象[25]，而其對酸和熱的適應(yīng)能力顯示，弱酸或高溫短時滅菌并不能保證副溶血性弧菌全部滅活，因此，在水產(chǎn)品加工處理過程中，為有效殺滅致病性微生物副溶血性弧菌，可將酸處理、熱處理、冷凍、添加防腐劑等多種技術(shù)協(xié)同使用[26]。

副溶血性弧菌在應(yīng)對惡劣環(huán)境和感染宿主等過程中，需要相應(yīng)的應(yīng)激調(diào)控相關(guān)基因的表達，啟動脅迫反應(yīng)以適應(yīng)各種應(yīng)激環(huán)境，因此，對脅迫反應(yīng)的研究有助于全面了解微生物生理活性，有助于開發(fā)新的抗微生物制劑和制定新的食品安全措施。然而，隨著對脅迫反應(yīng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)脅迫反應(yīng)的復(fù)雜性和關(guān)聯(lián)性等作用機制有待于進一步研究，如副溶血性弧菌的脅迫響應(yīng)機制和信號傳導(dǎo)過程、副溶血性弧菌在長期的脅迫過程中所產(chǎn)生的抗逆性、在應(yīng)對水產(chǎn)品流通中多種逆境因素的共同脅迫響應(yīng)機制等。隨著基因組[27]、轉(zhuǎn)錄組[28]、蛋白質(zhì)組[29]及代謝組學[30]的飛速發(fā)展，全基因組表達譜、雙向蛋白質(zhì)組表達譜等分析技術(shù)可以從分子水平揭示各種環(huán)境脅迫下副溶血性弧菌脅迫耐受機制，將會對副溶血性弧菌的檢測、殺菌及預(yù)防等方面具有重要的指導(dǎo)意義，更加科學的防止該細菌對人類的危害。

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