鼠傷寒沙門菌rpoS基因缺失菌株的構(gòu)建及RpoS因子在環(huán)境脅迫下的作用

梁運改，桂 萌，王 順，劉 密，張 清，周 康,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100071）

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一。根據(jù)2015年歐洲食品安全局的年度報告，沙門菌是導(dǎo)致食物中毒的第二大類最常見的腸道致病菌[1]。人類感染沙門菌會引起發(fā)燒、腸胃炎、敗血癥等，這些癥患對社會經(jīng)濟和人類健康造成了很大的負面影響[2]。鼠傷寒沙門菌頻繁導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)與食用家禽產(chǎn)品有關(guān)。食源性致病菌在食品加工過程中或感染人體時會面臨各種環(huán)境脅迫，為適應(yīng)環(huán)境脅迫且提升其存活能力，這些細菌已進化出復(fù)雜的響應(yīng)體系[3]。

RpoS因子作為經(jīng)典的響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激的重要因子，被廣為研究，它在腸桿菌科細菌中影響細菌毒力，參與細菌克服高滲、氧等環(huán)境應(yīng)激[4]。RpoS因子促進食源性致病菌在惡劣環(huán)境中的存活率，因此也增加了食源性致病菌在食品中存在的風(fēng)險[5-6]。有研究表明在大腸桿菌內(nèi)，RpoS因子除了在穩(wěn)定期調(diào)控基因的表達外，還能在其應(yīng)對各種環(huán)境壓力時進行調(diào)控，不同的壓力條件可能導(dǎo)致特定的sRNAs的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)RpoS的翻譯[7]。當(dāng)大腸桿菌暴露在較高的滲透壓、變化的pH值、高溫和抗菌化合物等條件下時，RpoS因子會調(diào)控不同類型蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，這些蛋白質(zhì)包括酶類、膜蛋白、調(diào)控蛋白等[8-9]。RpoS因子與沙雷氏菌對高滲透壓的耐受性形成也有關(guān)[10]。微生物應(yīng)對滲透壓的途徑之一就是通過自身合成或從環(huán)境中吸收可溶性物質(zhì)[11]。RpoS因子能指導(dǎo)proP的轉(zhuǎn)錄，proP能夠運輸可溶性物質(zhì)如甜菜堿，RpoS還可以指導(dǎo)海藻糖的生物合成[12-15]。Shiroda等[16]為了解在滲透壓條件下沙門菌中rpoS基因?qū)ρ訙诘挠绊懀ㄟ^比較沙門菌rpoS基因缺失菌株和親本菌株在滲透壓條件下的延滯期，發(fā)現(xiàn)rpoS基因的缺失會導(dǎo)致沙門菌的延滯期延長。為了研究RpoS因子對鼠傷寒沙門菌在外界壓力條件下的影響，本研究用Red同源重組技術(shù)[17]構(gòu)建rpoS基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS，通過比較親本菌株SL1344和基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS在3.5% NaCl（滲透壓）、高溫、低pH值以及在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)中預(yù)先處理不同時間后置于3.5% NaCl中生長情況，對RpoS因子在環(huán)境壓力下的作用進行深入的了解，從而為沙門菌疾病的預(yù)防及治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

鼠傷寒沙門菌SL1344由英國食品研究所贈送；Red同源重組系統(tǒng)工具pKD3、pKD46和pCP20 武漢淼靈生物科技有限公司。

pKD3含有氯霉素抗性基因，作為模板擴增含有同源臂的PCR打靶片段；pKD46是溫敏型質(zhì)粒，在30 ℃培養(yǎng)時可以正常復(fù)制，而高于37 ℃時會自動丟失，在pKD46上還含有受araB啟動子調(diào)控的exo、bet、gam基因，它們通過L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達，并攜帶氨芐青霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記。pCP20是一種溫敏性復(fù)制子，有氨芐青霉素和氯霉素兩種抗性，同時包含有FLP重組酶的基因，在42 ℃可以誘導(dǎo)重組酶的表達，特異地識別結(jié)合于FRT位點，F(xiàn)RT位點自身發(fā)生同源重組，丟掉抗性基因片段，失去一個FRT位點，達到去掉引入的抗性基因片段的目的。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基（NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉5 g/L、瓊脂粉1.5%，pH值調(diào)至7.0±0.2）、最低營養(yǎng)培養(yǎng)基（basic minimal medium，BMM）[18]、L-阿拉伯糖、SOC（super optimal broth）培養(yǎng)基配制參照文獻[19]，配方中的試劑均購于成都萬科實業(yè)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 天根科技（北京）有限公司；DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix大連寶生物工程有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Gene Pulser XcellTM電穿孔系統(tǒng)、T100 PCR儀、1645050電泳儀、SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；3K15離心機 美國Sigma公司；ZHP-160振蕩培養(yǎng)箱 常州國宇儀器制造有限公司；DHP-9162B電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)沙門菌基因組（NC_016810.1）rpoS基因序列和pKD3質(zhì)粒上氯霉素抗性基因設(shè)計引物C1/C2，擴增含有同源臂的氯霉素抗性片段。S1/S2為rpoS基因敲除后的鑒定引物。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列（5’-3’）見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primers used in this study

1.3.2 沙門菌rpoS基因的敲除

1.3.2.1 PCR打靶片段的制備

以質(zhì)粒pKD3為模板，C1和C2為引物，進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，然后用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收。

1.3.2.2 感受態(tài)細胞的制備和質(zhì)粒pKD46的電轉(zhuǎn)化

取OD600nm為0.7左右的新鮮培養(yǎng)的SL1344，4 ℃冰浴15min，4 000 r/min離心10min，棄上清液，用無菌ddH2O重懸洗滌菌體3 次，每次4 000 r/min離心10 min，棄上清液；再用體積分?jǐn)?shù)10%的甘油洗滌2 次，每次4 000 r/min離心10 min，棄上清液；沉淀用500 μL的10%甘油重懸保種。取一支制備好的感受態(tài)細胞SL1344，加入1 μL pKD46，混勻；電轉(zhuǎn)化（2.3 kV，5 ms）后加入1 mL SOC培養(yǎng)基，混勻后全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，取150 μL涂布到含有氨芐青霉素的LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.2.3 PCR打靶片段的電轉(zhuǎn)化

取0.5 mL新鮮培養(yǎng)的含有pKD46的SL1344接種于50 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.2，加L-阿拉伯糖（終濃度30 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm約為0.8，用1.3.2.2節(jié)的方法制備含有pKD46的感受態(tài)細胞SL1344/ pKD46。取一支感受態(tài)細胞，加入5 μL的1.3.2.1節(jié)中回收的PCR片段進行電轉(zhuǎn)化（2.3 kV，5 ms），轉(zhuǎn)化后的步驟同1.3.2.2節(jié)，將重懸菌液涂布到氯霉素的LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并且用引物S1和S2對陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證。挑取陽性轉(zhuǎn)化子至含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)OD600nm約為0.8，取200 μL涂布于含氯霉素的LB平板上，42 ℃培養(yǎng)至長出單菌落，挑取單菌落分別劃線于LB平板和含氨芐青霉素的LB平板，若在LB平板上生長而在含氨芐青霉素的LB平板上不生長，則pKD46質(zhì)粒已被消除。

1.3.2.4 抗性基因的消除

用1.3.2.2節(jié)的方法制備感受態(tài)細胞SL1344/ΔrpoS::Cmlr，取100 μL感受態(tài)細胞于1.5 mL預(yù)冷的離心管中，加入1 μL的質(zhì)粒pCP20進行電轉(zhuǎn)化（2.3 kV，5 ms），轉(zhuǎn)化后步驟同1.3.2.2節(jié)，取150 μL菌懸液涂布到含氨芐青霉素的LB平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。然后挑取成功的轉(zhuǎn)化子接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)OD600nm約為0.8，然后將菌液涂布在不含抗生素的LB平板上，42 ℃培養(yǎng)至長出單菌落，將單菌落分別接種含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，在平板上均不長的為抗性基因和pCP20成功消除的菌株且rpoS基因也成功敲除。并且用引物S1/S2對rpoS基因敲除的菌株進行PCR驗證。將rpoS基因成功敲除的菌株SL1344/ΔrpoS用-80 ℃甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SL1344和SL1344/ΔrpoS在環(huán)境脅迫下的生長

將在-80 ℃甘油保存的SL1344和SL1344/ΔrpoS在LB液體培養(yǎng)基中活化2 次，在BMM培養(yǎng)基中馴化5 次后將菌株分別接種至3.5% NaCl、42℃、pH 4.0的BMM培養(yǎng)基中，分別對這3 種脅迫進行生長研究，初始接種量均為104CFU/mL，間隔合適的時間取1 mL菌液，稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?，以平板計?shù)法（傾注法）進行生長曲線的測定。實驗所得數(shù)據(jù)用Origin 8.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并繪制生長曲線。

1.3.4 SL1344和SL1344/ΔrpoS在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理不同時間后置于滲透壓（3.5% NaCl）中的生長

將馴化好的菌株（接種量106CFU/mL）分別接種至含有0%、3.5%、5% NaCl的BMM培養(yǎng)基中分別刺激0.5、1、3 h后，再分別取3mL接種至含3.5% NaCl的300 mL的BMM培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)，間隔合適的時間取1 mL菌液，稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?，以平板計?shù)法（傾注法）進行生長曲線的測定。實驗所得數(shù)據(jù)用Origin 8.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株SL1344/ΔrpoS的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 PCR打靶片段的制備

以質(zhì)粒pKD3為模板，含有rpoS同源臂的C1和C2為引物，進行PCR擴增，產(chǎn)物兩側(cè)為39 bp的rpoS基因上、下游同源區(qū)序列，中間為氯霉素抗性基因，預(yù)期長度為1 133 bp，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖1a。

圖1 缺失菌株SL1344/ΔrpoS的構(gòu)建與鑒定Fig. 1 Construction and identification of SL1344/ΔrpoS

2.1.2 SL1344/ΔrpoS::Cmlr菌株的鑒定

用電轉(zhuǎn)化的方式將含rpoS同源臂的氯霉素抗性PCR片段轉(zhuǎn)入含有pKD46的沙門菌SL1344中，42 ℃消除pKD46質(zhì)粒，再用含有氯霉素的LB平板對陽性重組菌株進行篩選，得到SL1344/ΔrpoS::Cmlr菌株。PCR產(chǎn)物預(yù)期長度為1 432 bp，用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，以S1和S2為引物，結(jié)果見圖1b。

2.1.3 沙門菌rpoS基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS的鑒定

以電轉(zhuǎn)的方式將pCP20轉(zhuǎn)入SL1344/ΔrpoS::Cmlr菌株中，先30℃培養(yǎng)，消除抗性基因，再42 ℃培養(yǎng)，消除質(zhì)粒pCP20，通過抗性篩選，將遺傳穩(wěn)定的rpoS基因缺失的SL1344菌株保存并命名為SL1344/ΔrpoS。以S1和S2為引物對親本菌株和基因缺失菌株進行PCR擴增，結(jié)果顯示rpoS基因成功敲除，SL1344/rpoS菌株成功構(gòu)建。缺失菌株和親本菌株的PCR片段預(yù)期長度為500 bp和1 300 bp，瓊脂糖凝膠電泳鑒定見圖1c，泳道1為rpoS基因缺失菌株的PCR鑒定，泳道2為原始菌株的PCR鑒定。

2.2 SL1344和SL1344/ΔrpoS在環(huán)境脅迫下的生長

圖2 SL1344和SL1344/ΔrpoS在環(huán)境脅迫下的生長曲線Fig. 2 Growth curves of SL1344 and SL1344/ΔrpoS in stressful environments

菌株SL1344和SL1344/ΔrpoS在3.5% NaCl中的生長情況如圖2a所示，二者均有延滯期，與親本菌株SL1344相比，SL1344/ΔrpoS在延滯期的菌濃度下降較快，且在對數(shù)期相同時間點，SL1344/ΔrpoS的菌濃度均小于SL1344，SL1344先到達穩(wěn)定期，通過DMFit（http://browser.combase.cc/DMFit.aspx）軟件將二者的生長曲線進行擬合，得到的結(jié)果為：SL1344的最大生長速率為SL1344/ΔrpoS的2.49 倍。SL1344和SL1344/ΔrpoS在42 ℃條件下的生長曲線如圖2b所示，在對數(shù)期的相同時間點，SL1344菌濃度均大于SL1344/ΔrpoS菌濃度，而在穩(wěn)定期，二者的菌濃度基本相同（109CFU/mL），通過DMFit軟件將二者的生長曲線進行擬合，其結(jié)果為：SL1344的最大生長速率為SL1344/ΔrpoS的1.33 倍。SL1344和SL1344/ΔrpoS在pH 4.0條件下的生長曲線如圖2c所示，二者的生長情況相差較大，在整個生長周期中的相同時間點，SL1344/ΔrpoS的菌濃度一直小于SL1344，SL1344先到達穩(wěn)定期，且SL1344在穩(wěn)定期的菌濃度（108CFU/mL）大于SL1344/ΔrpoS菌濃度（106CFU/mL），通過DMFit軟件將二者的生長曲線進行擬合，得到的結(jié)果為：SL1344的最大生長速率為SL1344/ΔrpoS的2.77 倍。與在3.5% NaCl中的生長相比，SL1344和SL1344/ΔrpoS在42 ℃和pH 4.0條件下到達穩(wěn)定期的時間均較短。

2.3 SL1344和SL1344/ΔrpoS在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)中處理不同時間后置于3.5% NaCl中的生長

圖3 SL1344（a）和SL1344/ΔrpoS（b）在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)中刺激不同時間后置于3.5% NaCl中培養(yǎng)后的生長曲線Fig. 3 Growth curves of SL1344 (a) and SL1344/ΔrpoS (b) in BMM containing 3.5% NaCl after being stimulated by different concentrations of NaCl for different times

如圖3所示，與SL1344和SL1344/ΔrpoS在不加鹽的BMM中的生長情況相比，二者的生長均受到抑制，且SL1344/ΔrpoS受到的抑制作用更大。從圖3a可以看出，SL1344在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、3.5%、5% NaCl）中刺激相同時間后的延滯期均為：0%＜3.5%＜5%；且用不同的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理后，SL1344到達穩(wěn)定期時的菌濃度均為107～108CFU/mL；SL1344在0% NaCl分別處理0.5、1、3 h后，處理3 h的延滯期最短，最先達到穩(wěn)定期，在5% NaCl中分別處理0.5、1、3 h后，處理3 h的延滯期最長，到達穩(wěn)定期的時間也最短。從圖3b可以根據(jù)培養(yǎng)時間看出，在相同的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時間的處理條件下，SL1344/ΔrpoS到達穩(wěn)定期的時間均比SL1344長；SL1344/ΔrpoS在0%和3.5% NaCl中處理后，二者的生長趨勢一致，在對數(shù)期的相同時間點的菌濃度大小均為1 h＜0.5 h＜3 h；在5% NaCl中刺激不同時間后，SL1344/ΔrpoS的菌濃度迅速下降，特別是刺激3 h之后，SL1344/ΔrpoS菌濃度降至0后基本沒有恢復(fù)活性；SL1344/ΔrpoS在0%和3.5% NaCl處理0.5 h和3 h之后，在對數(shù)后期的相同時間點，3.5% NaCl處理的菌株濃度均超越0% NaCl處理的菌株濃度，而處理1 h的與之相反。

3 討 論

鼠傷寒沙門菌是十分常見的食源性致病菌。在食品行業(yè)中，環(huán)境壓力會導(dǎo)致微生物中很多受到RpoS因子調(diào)控的基因的表達[20]。大腸桿菌K12的轉(zhuǎn)錄組情況分析表明其中10%～20%的基因受到RpoS的直接或者間接調(diào)控[21-22]。RpoS因子在鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028新陳代謝和膜功能方面起著主要的作用，除此之外，RpoS還調(diào)控大量sRNA，這些sRNA可能賦予RpoS一些功能，影響mRNA的穩(wěn)定性或者蛋白穩(wěn)定性[23-24]。本研究用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建rpoS基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS，并且在不同條件下對親本菌株SL1344和基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS進行培養(yǎng)，對二者的生長情況進行比較，從而對RpoS因子的作用進行更深入的了解。

在食物中加鹽可以提高食物環(huán)境的滲透壓從而抑制有害微生物的生長，因此鹽是保存食物的常見方法。在滲透壓條件下，微生物會為了生存而逐漸適應(yīng)此環(huán)境，RpoS為微生物對滲透壓的適應(yīng)提供了條件，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達使其適應(yīng)滲透壓而存活[25-26]。根據(jù)本研究的結(jié)果，與SL1344和SL1344/ΔrpoS在不加鹽的BMM中的生長情況相比，在滲透壓（3.5% NaCl）條件下，二者均出現(xiàn)延滯期，穩(wěn)定期時的菌濃度也比其在不加鹽的條件下的菌濃度?。ú患欲}條件下穩(wěn)定期菌濃度均為109CFU/mL），且SL1344/ΔrpoS在延滯期菌濃度下降幅度更大，說明滲透壓對鼠傷寒沙門菌的生長有抑制，且RpoS因子能增強鼠傷寒對滲透壓的適應(yīng)能力。Zhang Xia等[27]將鼠傷寒沙門菌野生菌株和rpoS基因缺失菌株置于較高滲透壓（NaCl終濃度為300 mmol/L）條件下檢測其生長情況，結(jié)果顯示基因缺失菌株的生長明顯比野生菌株慢（P＜0.05）。此結(jié)果與本研究得到的結(jié)果一致。鼠傷寒沙門菌的最適生長溫度是37 ℃，本研究選擇在42 ℃條件下比較親本菌株和基因缺失菌株的生長情況，發(fā)現(xiàn)在42 ℃的高溫脅迫條件下，rpoS基因的缺失對鼠傷寒沙門菌在此條件下的最高活菌數(shù)的影響較小，雖然SL1344/rpoS在對數(shù)期的生長速度比SL1344慢，但到達穩(wěn)定期時二者的菌濃基本達到一致，說明在42℃條件下，RpoS對鼠傷寒沙門菌的生長影響不大。Yang Yishan等[28]通過對不同溫度（10、25、37、42 ℃）條件下培養(yǎng)的腸炎沙門菌中rpoH表達量的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在42 ℃時rpoH表達量最高。在高溫條件下，RpoH通過調(diào)控?zé)釗舻鞍椎霓D(zhuǎn)錄來保護細胞免受胞質(zhì)熱應(yīng)力作用的影響[29]。因此，鼠傷寒沙門菌在較高溫度條件下的存活，起主要作用的可能是RpoH，而不是RpoS。鼠傷寒沙門菌生長的最適pH值為7.0，本研究在pH 4.0的條件下比較SL1344和SL1344/ΔrpoS的生長情況，發(fā)現(xiàn)在此條件下，處于對數(shù)期的SL1344/ΔrpoS生長能力明顯弱于SL1344，穩(wěn)定期時二者菌濃相差較大（分別為108CFU/mL和106CFU/mL），暗示RpoS因子在pH 4.0條件下對鼠傷寒沙門菌的適應(yīng)能力起到一定的作用，且rpoS基因的缺失會導(dǎo)致沙門菌在此條件下生存能力下降。Burin等[30]將沙門菌置于在pH 5.0和pH 6.0條件下培養(yǎng)，檢測rpoS基因表達量，發(fā)現(xiàn)沙門菌對酸性條件的適應(yīng)與rpoS基因的表達有關(guān)。與鼠傷寒沙門菌SL1344在42 ℃和pH 4.0條件下的生長情況相比，在滲透壓（3.5% NaCl）條件下，SL1344到達穩(wěn)定期所需要的時間最長，證明在這3 種條件下，滲透壓（3.5% NaCl）對其抑制作用最大。此外，國內(nèi)有學(xué)者也就腸炎沙門菌rpoS基因缺陷株在不同環(huán)境中進行了綜合分析[31]，得到了與本研究類似的結(jié)果。

為了解鼠傷寒沙門菌在不同滲透壓中處理不同時間后的生長情況，本研究將SL1344和SL1344/ΔrpoS于0%、3.5%、5% NaCl中分別處理0.5、1、3 h后置于3.5% NaCl培養(yǎng)（圖3）。SL1344在3 種鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)中處理同一特定時間后的延滯期均為：0%＜3.5%＜5%，表明延滯期與鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，延滯期延長；在0% NaCl中處理后，由于生長初期沒有鹽的刺激，SL1344的生長不受抑制，生長較快，即使處理后置于3.5% NaCl中培養(yǎng)，菌濃度已上升，對滲透壓環(huán)境的適應(yīng)能力較強，因此延滯期較短，而在3.5% NaCl中處理后，由于SL1344的初期生長受到限制，所以生長緩慢，再置于3.5% NaCl中培養(yǎng)時，菌可能仍然在適應(yīng)過程中，因此延滯期較長，同樣，在5% NaCl中處理后，菌生長初期受到的限制作用更強，因此生長更慢，延滯期更長；rpoS基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS在0%和3.5% NaCl中處理同一特定時間后的生長情況相似，均為處理3 h的先到達穩(wěn)定期，處理0.5 h的次之，處理1 h的最后達到穩(wěn)定期，到達穩(wěn)定期的先后順序并不是按照處理時間的長短依次上升或遞減，表明rpoS基因的缺失會抑制SL1344/ΔrpoS的生長，同時也暗示了rpoS基因的缺失會可能會導(dǎo)致SL1344/ΔrpoS對滲透壓的耐受時間有一定的閾值，大于或小于這個時間，SL1344/ΔrpoS受到的抑制作用都會減小。SL1344/ΔrpoS在5% NaCl中處理后，菌濃度迅速下降，與SL1344相比，其對5% NaCl的耐受性明顯下降，并且隨著刺激時間的延長，SL1344/ΔrpoS在3.5% NaCl中的生長能力越來越弱，說明RpoS因子在鼠傷寒沙門菌面對較高滲透壓時對其自身起到一定的保護作用。

本研究通過對沙門菌親本菌株SL1344和基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS在滲透壓（3.5% NaCl）、pH 4.0、42 ℃條件下的生長情況對比，發(fā)現(xiàn)在這些條件下，鼠傷寒沙門菌受到的抑制作用依次減小。在相同條件下，rpoS基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS的生長情況均弱于親本菌株SL1344；且SL1344和SL1344/ΔrpoS在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)中處理特定時間后的生長情況也存在差異。這些情況為進一步了解RpoS因子在各種環(huán)境脅迫下的作用機制提供幫助，同時也為提供更加有效的預(yù)防和控制沙門菌疾病措施提供理論支持。

[1] ZADERNOWSKA A, CHAJ?CKA-WIERZCHOWSKA W.Prevalence, biofilm formation and virulence markers of Salmonella sp. and Yersinia enterocolitica, in food of animal origin in Poland[J].LWT-Food Science and Technology, 2017, 75: 552-556. DOI:10.1016/j.lwt.2016.10.007.

[2] PARK H C, BAIG I A, LEE S C, et al. Development of ssDNA aptamers for the sensitive detection of Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2014, 174(2): 793-802. DOI:10.1007/s12010-014-1103-z.

[3] TAN H J, LIU S H, OLIVER J D, et al. Role of RpoS in the susceptibility of low salinity-adapted Vibrio vulnificus to environmental stresses[J]. International Journal of Food Microbiology,2010, 137(2/3): 137-142. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.12.006.

[4] DONG T, SCHELLHORN H E. Role of RpoS in virulence of pathogens[J]. Infection & Immunity, 2010, 78(3): 887-897.DOI:10.1128/IAI.00882-09.

[5] DODD C E, ALDSWORTH T G. The importance of RpoS in the survival of bacteria through food processing[J]. International Journal of Food Microbiology, 2002, 74(3): 189-194. DOI:10.1016/S0168-1605(01)00679-1.[6] VASUDEVAN P, VENKITANARAYANAN K. Role of the rpoS gene in the survival of Vibrio parahaemolyticus in artificial seawater and fish homogenate[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(6):1438-1442. DOI:10.4315/0362-028X-69.6.1438.

[7] BATTESTI A, MAJDALANI N, GOTTESMAN S. The RpoS-mediated general stress response in Escherichia coli[J]. Annual Review of Microbiology, 2011, 65(65): 189-213. DOI:10.1146/annurev-micro-090110-102946.

[8] AITOUAZZOU A, CHERRAT L, ESPINA L, et al. The antimicrobial activity of hydrophobic essential oil constituents acting alone or in combined processes of food preservation[J]. Innovative Food Science &Emerging Technologies, 2011, 12(3): 320-329. DOI:10.1016/j.ifset.2011.04.004.

[9] SOMOLINOS M, GARCíA D, MA?AS P, et al. Effect of environmental factors and cell physiological state on pulsed electric fields resistance and repair capacity of various strains of Escherichia coli[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(3): 260-267. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.021.

[10] LIU X, WU Y, CHEN Y, et al. RpoS diあerentially aあects the general stress response and biofilm formation in the endophytic Serratia plymuthica G3[J]. Research in Microbiology, 2015, 167(3): 168-177.DOI:10.1016/j.resmic.2015.11.003.

[11] O’BYRNE C P, BOOTH I R. Osmoregulation and its importance to food-borne microorganisms[J]. International Journal of Food Microbiology, 2002, 74(3): 203-216. DOI:10.1016/S0168-1605(01)00681-X.

[12] MELLIES J, WISE A, VILLAREJO M. Two different Escherichia coli proP promoters respond to osmotic and growth phase signals[J].Journal of Bacteriology, 1995, 177(1): 144-151. DOI:10.1128/jb.177.1.144-151.1995.

[13] IBANEZRUIZ M, ROBBESAULE V, HERMANT D, et al.Identification of RpoS (sigma(S))-regulated genes in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. Journal of Bacteriology, 2000,182(20): 5749-5756. DOI:10.1128/JB.182.20.5749-5756.2000.

[14] VIJAYAKUMAR S R V, KIRCHHOF M G, PATTEN C L, et al.RpoS-Regulated genes of Escherichia coli identified by random lacZ fusion mutagenesis[J]. Journal of Bacteriology, 2005, 186(24):8499-8507. DOI:10.1128/JB.186.24.8499-8507.2004.

[15] DONG T, SCHELLHORN H E. Global effect of RpoS on gene expression in pathogenic Escherichia coli, O157:H7 strain EDL933[J].BMC Genomics, 2009, 10(349): 1-17. DOI:10.1186/1471-2164-10-349.

[16] SHIRODA M, PRATT Z L, D?PFER D, et al. RpoS impacts the lag phase of Salmonella enterica during osmotic stress[J]. Fems Microbiology Letters, 2014, 357(2): 195-200. DOI:10.1111/1574-6968.12523.

[17] 呂沈聰, 趙穎穎, 鐘衛(wèi)鴻. Red同源重組在大腸桿菌基因敲除中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)與生物工程, 2013, 30(6): 1-6. DOI:10.3969/j.issn.1672-5425.2013.06.001.

[18] ZHOU K, GEORGE S M, MéTRIS A, et al. Lag phase of Salmonella enterica under osmotic stress conditions[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2011, 77(5): 1758-1762. DOI:10.1128/AEM.02629-10.

[19] 許彤, 劉欽松, 張叢叢, 等. 高效JM109感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 51(21): 4902-4904. DOI:10.3969/j.issn.0439-8114.2012.21.060.

[20] KOCHARUNCHITT C, KING T, GOBIUS K, et al. Global genome response of Escherichia coli O157:H7 Sakai during dynamic changes in growth kinetics induced by an abrupt downshift in water activity[J].PLoS ONE, 2014, 9(3). DOI:10.1371/journal.pone.0090422.

[21] PATTEN C L, KIRCHHOF M G, SCHERTZBERG M R, et al.Microarray analysis of RpoS-mediated gene expression in Escherichia coli K-12[J]. Molecular Genetics & Genomics, 2004, 272(5): 580-591.DOI:10.1007/s00438-004-1089-2.

[22] WEBER H, POLEN T, HEUVELING J, et al. Genome-wide analysis of the general stress response network in Escherichia coli: sigmaS-dependent genes, promoters, and sigma factor selectivity[J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(5): 1591-1603. DOI:10.1128/JB.187.5.1591-1603.2005.

[23] LéVIMEYRUEIS C, MONTEIL V, SISMEIRO O, et al. Expanding the RpoS/σS-network by RNA sequencing and identification of σS-controlled small RNAs in Salmonella[J]. PLoS ONE, 2014, 9(5):e96918. DOI:10.1371/journal.pone.0096918.

[24] LéVIMEYRUEIS C, MONTEIL V, SISMEIRO O, et al. Repressor activity of the RpoS/σS-dependent RNA polymerase requires DNA binding[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(3): 1456-1468.DOI:10.1093/nar/gku1379.

[25] MéTRIS A, GEORGE S M, ROPERS D. Piecewise linear approximations to model the dynamics of adaptation to osmotic stress by food-borne pathogens[J]. International Journal of Food Microbiology,2016, 240: 63-74. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2016.06.022.

[26] HAMNER S, MCINNERNEY K, WILLIAMSON K, et al. Bile salts aあect expression of Escherichia coli O157: H7 genes for virulence and iron acquisition, and promote growth under iron limiting conditions[J].PLoS ONE, 2013, 8(9): e74647. DOI:10.1371/journal.pone.0074647.

[27] ZHANG X, ZHU C W, YIN J, et al. RpoS affects gene expression in Salmonella enterica serovar Typhi under early hyperosmotic stress[J].Current Microbiology, 2017, 74(6): 1-5. DOI:10.1007/s00284-017-1243-9.

[28] YANG Y S, KHOO W J, ZHENG Q, et al. Growth temperature alters Salmonella Enteritidi sheat/acid resistance, membrane lipid composition and stress/virulence related gene expression[J].International Journal of Food Microbiology, 2014, 172(1): 102-109.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.006.

[29] SPECTOR M P, KENYON W J. Resistance and survival strategies of Salmonella enterica, to environmental stresses[J]. Food Research International, 2012, 45: 455-481. DOI:10.1016/j.foodres.2011.06.056.

[30] BURIN R C K, JR A S, NERO L A. Influence of lactic acid and acetic acid on Salmonella, spp. growth and expression of acid tolerancerelated genes[J]. Food Research International, 2014, 64: 726-732.DOI:10.1016/j.foodres.2014.08.019.

[31] 曾紅亮, 曾慶梅, 喬向欣, 等. 腸炎沙門氏菌rpoS基因缺陷株的構(gòu)建及其生長特性觀察[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2013(8): 690-694.DOI:10.13350/j.cjpb.2013.08.001.