1 株高產(chǎn)L-乳酸菌株的分離鑒定及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

孫麗慧，王云曉，呂詩文，李 曼，賀雷雨，包永明

（1.大連理工大學食品與環(huán)境學院，遼寧 盤錦 124221；2.大連理工大學生命與醫(yī)藥學院，遼寧 盤錦 124221）

乳酸又名2-羥基丙酸，是一種重要的多用途有機酸，被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)[1-2]。乳酸按其構(gòu)型和旋光性可分為D-型、L-型和DL-型3 種類型，由于人體只具有L-乳酸脫氫酶，因此只能代謝L-型的乳酸，若過量攝入D-型或DL-型的乳酸則會引起人體代謝功能紊亂、造成酸中毒等不良反應[3]。世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定，D-型或DL-型的乳酸不得加入到嬰幼兒食品中，而成人每天攝入的D-型乳酸也不能超過100 mg/kg體質(zhì)量[4]。目前工業(yè)生產(chǎn)的乳酸約70%作為酸浸劑、調(diào)味劑、防腐劑等功能用于食品行業(yè)中，因而，高光學純L-乳酸的生產(chǎn)受到了越來越多的關(guān)注[5-6]。

微生物發(fā)酵法是L-乳酸的主要生產(chǎn)方法，所涉及的微生物主要包括一些絲狀真菌、乳酸細菌和部分芽孢桿菌等，該方法具有產(chǎn)物光學純度相對較高、生產(chǎn)工藝簡單、副產(chǎn)物少、能耗小等優(yōu)勢[7-11]。盡管國內(nèi)外眾多學者多年來已經(jīng)在發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸取得了很多的研究成果，但目前研究中仍存在一些不足之處，或是乳酸的產(chǎn)酸量不高，糖酸轉(zhuǎn)化率低[12-15]；或是產(chǎn)物乳酸中含有較多的D-型乳酸，目標產(chǎn)物L-乳酸的光學純度較低，造成下游L-乳酸的分離提純較為困難[16]；或是產(chǎn)生菌對營養(yǎng)物質(zhì)要求較高，往往需要價格較貴的酵母粉或酵母膏作為氮源才能獲得較高的乳酸產(chǎn)量，增加了發(fā)酵的成本[17-20]，這些問題都不利于L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本研究旨在篩選獲得1 株高產(chǎn)乳酸且L-乳酸光學純度較高的菌株并對其進行生理生化和分子生物學鑒定，進而對培養(yǎng)基進行初步優(yōu)化，尋求廉價氮源部分替代酵母粉或酵母膏，以期降低生產(chǎn)成本，并在5 L發(fā)酵罐中進行批式流加發(fā)酵以驗證其發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的潛能，為乳酸發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供1 株可供選擇的優(yōu)良菌株及其發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

市售酸奶、辣白菜、榨菜、奶酪、泡菜汁、新鮮水果、海水及從遼寧不同地方采集的下層土壤等樣品共120余份。

1.1.2 試劑

L/D-乳酸檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；CBC棒狀桿菌鑒定卡 法國梅里埃公司；革蘭氏染色液試劑盒 青島海博生物技術(shù)有限公司；TaKaRa 16S rDNA Gene Bacterial Identification PCR Kit、TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 寶生物工程（大連）有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、瓊脂北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離液體培養(yǎng)基：采用MRS培養(yǎng)基并添加溴甲酚紫0.1 g/L作為指示劑[21]。

分離平板培養(yǎng)基：為改良的MRS培養(yǎng)基，即CaCO3-溴甲酚紫MRS平板培養(yǎng)基，在MRS培養(yǎng)基中加入CaCO320 g/L、溴甲酚紫0.1 g/L作為指示劑，瓊脂15 g/L[21]。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，其他同文獻[21]。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g、酵母粉10 g、CH3COONa 4 g、KH2PO41 g、MgSO40.1 g、MnSO40.4 g、吐溫80 1 mL、CaCO320 g，充分溶解后用蒸餾水定容至1 L。

1.2 儀器與設備

VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定儀、麥氏比濁儀法國梅里埃公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-5800紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司；SBA-40C生物傳感分析儀山東省科學院生物研究所；HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；N-300M熒光顯微鏡 寧波永新光學股份有限公司；BIOTECH-5BG發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

取適量樣品加入至30 mL無菌水中，充分振蕩后靜止片刻，取上層清液1 mL加放入到分離液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。選取發(fā)酵液顏色變黃的樣品，經(jīng)稀釋后涂布于分離平板培養(yǎng)基，待長出菌落，挑取能夠水解CaCO3且變色圈較大的單菌落，接種到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，選取產(chǎn)物濃度高的菌落，進一步劃線純化直至純種，將其編號并保藏。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學觀察

肉眼直接觀察菌落的外部形態(tài)，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.2.2 生理生化鑒定

挑取純化的菌株加至3 mL生理鹽水中，振蕩混勻后利用麥氏比濁儀測定菌懸液濁度達到2.7～3.3麥氏濃度，按照CBC棒狀桿菌鑒定卡的操作說明書進行VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)分析。

1.3.2.3 菌株16S rDNA序列擴增與分析

挑取培養(yǎng)基上的菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buあer for Microorganism to Direct PCR（Code No.9164）中變性后離心取上清液作為模板，反應條件：80 ℃，15 min；然后使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No.RR176）進行PCR擴增目的片段；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段；由大連寶生物工程有限公司進行測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫在線BLAST系統(tǒng)進行序列比對，以確定種屬。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

1.3.3.1 培養(yǎng)基中初始碳源質(zhì)量濃度的優(yōu)化

在基礎培養(yǎng)基的基礎上，分別以40～140 g/L的葡萄糖為碳源，按2%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，定期取樣監(jiān)測，考察初始糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響。

1.3.3.2 培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化

在基礎培養(yǎng)基的基礎上，以40 g/L的葡萄糖為碳源，分別以20 g/L的酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、棉籽餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、硝酸銨、硫酸銨作為氮源，考察不同種類的氮源對發(fā)酵的影響，發(fā)酵時間為24 h，其他培養(yǎng)條件同1.3.3.1節(jié)。在此基礎上，為進一步降低氮源成本，利用發(fā)酵效果相對較好的廉價氮源按照一定配比進行部分替代，考察不同配比的復合氮源對發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響。

1.3.3.3 培養(yǎng)基中無機鹽的優(yōu)化

在上述優(yōu)化的基礎上，以40 g/L的葡萄糖為碳源，10 g/L的酵母粉+15 g/L棉籽餅粉為氮源，分別考察不同質(zhì)量濃度的CH3COONa、KH2PO4、MgSO4及MnSO4對發(fā)酵的影響，發(fā)酵時間為24 h，其他培養(yǎng)條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.4 5 L發(fā)酵罐中的批式流加發(fā)酵實驗

根據(jù)上述搖瓶中的優(yōu)化結(jié)果，進而在5 L發(fā)酵罐中進行了批式流加發(fā)酵，考察菌株的生長及L-乳酸的成情況。發(fā)酵條件如下：裝液量2 L，接種量10%，發(fā)酵溫度37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，4 mol/L NaOH溶液維持pH 6.0，發(fā)酵通氣量0.2 m3/min，發(fā)酵初始葡萄糖質(zhì)量濃度80 g/L，中間補加葡萄糖使其質(zhì)量濃度維持在30～80 g/L之間，發(fā)酵72 h。

1.3.5 分析方法

L-乳酸純度的測定：利用L-/D-乳酸檢測試劑盒測定乳酸的光學純度，光學純度的計算方法參照文獻[22]；L-乳酸質(zhì)量濃度的測定：用SBA-40C生物傳感分析儀測定[23]；還原糖含量的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicvlic acid，DNS）比色法[24]；菌體濃度的測定：利用分光光度計測定OD600nm表示菌體的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)L-乳酸菌株的篩選

利用分離液體培養(yǎng)基培養(yǎng)來源不同的120余份樣品，其中16 份樣品的發(fā)酵液變成黃色，經(jīng)稀釋后涂布于CaCO3-溴甲酚紫MRS分離平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其中有5 株產(chǎn)酸圈較大，將其轉(zhuǎn)接到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，檢測發(fā)酵液中L-乳酸的產(chǎn)量，結(jié)果如表1所示。

從表1可知，從辣白菜樣品中篩選獲得的菌株LB-103在分離液體培養(yǎng)基中顯色速度最快，并且在分離平板培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸圈直徑達10.5 mm，這些現(xiàn)象均說明該菌株具有較強的產(chǎn)酸能力，進一步通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)檢測證實，菌株LB-103的L-乳酸產(chǎn)量最高，達到15.40 g/L。更重要的是，采用L/D-乳酸檢測試劑盒檢測乳酸的光學純度，結(jié)果表明，菌株LB-103只產(chǎn)生L-乳酸，無D-乳酸生成。因此，將該菌株進行進一步純化直至純種，保藏待用。

表1 不同菌株產(chǎn)L-乳酸的能力Table 1 L-Lactic acid produced by different strains isolated from different sources

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學觀察

將菌株LB-103在固體MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌株在平板上的單菌落呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤，不透明，邊緣整齊，顏色為乳白色（圖1a）。細菌革蘭氏染色呈陽性，短桿狀（圖1b）。

圖1 LB-103菌株菌落形態(tài)（a）和革蘭氏染色照片（b）Fig. 1 Colony morphology (a) and gram staining (b) of strain LB-103

2.2.2 菌株生理生化鑒定

表2 LB-03菌株的主要生理學特征Table 2 Physiological characteristics of strain LB-03

經(jīng)過純化的菌株LB-103利用VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)進行生理生化鑒定，鑒定的結(jié)果為鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus rhamnosus），可信度達95%，結(jié)果評價為Excellent identification（極好的鑒定）。具體生化反應結(jié)果見表2。

2.2.3 菌株16S rDNA序列擴增

以菌株LB-103基因組DNA為模板經(jīng)過PCR擴增后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段大約為1 500 bp（圖2），將PCR產(chǎn)物回收純化后測序，確定該片段實際長度為1 337 bp。該序列已提交至GenBank，登記號為No.KY750318。將該序列在NCBI中BLAST比對發(fā)現(xiàn)，菌株LB-103與L. rhamnosus的同源性極高，序列相似性達到100%。結(jié)合上述生理生化鑒定結(jié)果，可確定該菌株為鼠李糖乳酸桿菌，并將其命名為鼠李糖乳酸桿菌DLF-15038（L. rhamnosus DLF-15038）。

圖2 菌株LB-103的16S rDNA凝膠電泳圖Fig. 2 Gel electrophoresis pattern of PCR amplified product of 16S rDNA from strain LB-103

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

2.3.1 碳源質(zhì)量濃度對L. rhamnosus DLF-15038發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸影響Fig. 3 Effects of glucose concentration on the production of L-lactic acid

如圖3所示，隨著糖質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液中L-乳酸產(chǎn)量逐漸增加。然而在初始糖質(zhì)量濃度為80 g/L時L-乳酸的生成速率最高，這可能是由于在高質(zhì)量濃度糖基質(zhì)中，發(fā)酵液滲透壓增加，從而對菌體生長及其代謝會造成一定的抑制作用。因此為獲得較高的L-乳酸產(chǎn)量，避免高糖質(zhì)量濃度對微生物造成的抑制作用，可以考慮選擇發(fā)酵初始糖質(zhì)量濃度為80 g/L，采用流加補料的方式進行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.3.2 氮源對L. rhamnosus DLF-15038發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

不同微生物對氮源的利用能力也不同，實驗選擇了文獻中發(fā)酵L-乳酸產(chǎn)量較高的幾種有機氮源如酵母粉、牛肉膏、蛋白胨[4,21-22,25-26]，同時又選擇了幾種廉價的有機氮源如棉籽餅粉、黃豆餅粉、玉米漿和無機氮源硝酸銨、硫酸銨，考察氮源種類對發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同氮源種類對L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of different nitrogen sources on the production of L-lactic acid

由圖4可以看出，在相同發(fā)酵條件下，有機氮源的發(fā)酵效果明顯好于無機氮源，這可能是由于有機氮源中除了含有蛋白質(zhì)、肽及游離的氨基酸以外，往往還含有少量的維生素和生長因子，可以滿足微生物生長和代謝的需要[17-18,25]。本實驗中以酵母粉作為氮源時L-乳酸產(chǎn)量最高，蛋白胨次之，該實驗結(jié)果與Kwon[26]、Nancib[27]、于雷[17]等的報道一致，且目前文獻中報道的高產(chǎn)L-乳酸所用的氮源也多為酵母粉[25]。然而酵母粉和蛋白胨都是價格昂貴的氮源，對于生產(chǎn)用途廣且用量大的L-乳酸產(chǎn)品來說，在獲得高產(chǎn)量和高轉(zhuǎn)化率的同時，也必須使用相對廉價的培養(yǎng)基成分，產(chǎn)品才更具有市場競爭力。本實驗中以廉價的棉籽餅粉作為氮源，L-乳酸產(chǎn)量雖然較酵母粉或蛋白胨低，但明顯好于黃豆餅粉和玉米漿，并且菌體生長情況與酵母粉作為氮源的發(fā)酵結(jié)果相當。因此，為減少酵母粉用量，降低發(fā)酵培養(yǎng)基成本，進一步考察利用棉籽餅粉部分替代酵母粉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的情況，結(jié)果如表3所示。

表3 復合氮源對L-乳酸產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of complex nitrogen sources on the production of L-lactic acid

從表3可以看出，10 g/L酵母粉分別添加15 g/L或20 g/L棉籽餅粉與15 g/L酵母粉分別添加15 g/L或20 g/L棉籽餅粉作為氮源，L-乳酸產(chǎn)量與單獨使用20 g/L酵母粉相當?？梢?，利用棉籽餅粉部分替代酵母粉是可行的。當以10 g/L酵母粉+15 g/L棉籽餅粉作為復合氮源時，在此基礎上無論是增加酵母粉或是棉籽餅粉的用量，L-乳酸產(chǎn)量均無明顯變化。因此，考慮培養(yǎng)基的成本，選擇以10 g/L酵母粉+15 g/L棉籽餅粉作為復合氮源最為合適。

2.3.3 無機鹽對L. rhamnosus DLF-15038發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

微生物的生長及其代謝產(chǎn)物合成過程中需要無機鹽和一些微量元素，很多無機鹽中的金屬離子是作為某些酶的激活劑，這些物質(zhì)往往在低質(zhì)量濃度時會促進微生物生長和代謝產(chǎn)物合成，但在高質(zhì)量濃度時卻會表現(xiàn)出明顯的抑制現(xiàn)象。本實驗考察了不同質(zhì)量濃度的CH3COONa、KH2PO4、MgSO4及MnSO4對發(fā)酵的影響，結(jié)果如表4所示。最佳無機鹽質(zhì)量濃度分別為CH3COONa 3 g/L、KH2PO42 g/L、MnSO40.3 g/L和MgSO40.2 g/L。

表4 不同質(zhì)量濃度的無機鹽對L-乳酸產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of different concentrations of inorganic salts on the production of L-lactic acid

2.4 5 L發(fā)酵罐中的批式流加發(fā)酵實驗

通過上述培養(yǎng)基優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基為初始葡萄糖質(zhì)量濃度80 g/L、棉籽餅粉15 g/L、酵母粉10 g/L、CH3COONa 3 g/L、KH2PO42 g/L、MnSO40.3 g/L、MgSO40.2 g/L、吐溫80 1 mL/L。在該條件下，在5 L發(fā)酵罐中進行了批式流加發(fā)酵，考察菌株的生長及L-乳酸的成情況，結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵72 h，L-乳酸產(chǎn)量可達165.15 g/L，生產(chǎn)強度為2.29 g/（L·h），葡萄糖總消耗量為176.94 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為93.34%。

圖5 分批補料發(fā)酵過程曲線Fig. 5 Time course curve of fed-batch fermentation

3 討論與結(jié)論

本實驗從辣白菜樣品中篩選出1 株高產(chǎn)乳酸的菌株LB-103，通過生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，確定該菌株為鼠李糖乳酸桿菌（L. rhamnosus），將其命名為鼠李糖乳酸桿菌DLF-15038。經(jīng)L-/D-乳酸試劑盒檢測該菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的光學純度為100%。純L-乳酸應用于食品行業(yè)中可以保證食品安全性，此外純L-乳酸還可以生產(chǎn)高質(zhì)量的聚乳酸。但目前國內(nèi)外關(guān)于利用細菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的報道中，產(chǎn)物大多都混有D-型的乳酸[12,16]，產(chǎn)純L-乳酸的報道較少。周穎等[22]對Lactococcus lactis KLDS 4.0325發(fā)酵產(chǎn)光學純度為100% L-乳酸的培養(yǎng)基優(yōu)化；高江婧等[28]從土壤樣品中篩選到1 株凝結(jié)芽孢桿菌，發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的光學純度達99%以上；Laopaiboon等[29]利用L. lactis IO-1發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)光學純度為100% L-乳酸；Ramchandran等[30]利用L. lactis ssp. cremoris ASCC 930119生產(chǎn)光學純度為100% L-乳酸。本實驗篩選獲得的L. rhamnosus DLF-15038不僅發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的光學純高，而且還具有非常好的產(chǎn)乳酸能力，在5 L發(fā)酵罐中進行批式流加發(fā)酵實驗，發(fā)酵72 h，L-乳酸產(chǎn)量為165.15 g/L，生產(chǎn)強度為2.29 g/（L·h），糖酸轉(zhuǎn)化率為93.34%。

對L. rhamnosus DLF-15038發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，廉價的棉籽餅粉可以部分替代酵母粉，采用15 g/L棉籽餅粉和10 g/L的酵母粉為復合氮源，L-乳酸的產(chǎn)量得以維持并顯著降低成本。Kwon等[24]曾在L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中用19.3 g/L大豆粉替代15 g/L的酵母粉，同樣可以獲得理想的發(fā)酵結(jié)果，但是需要在培養(yǎng)基中額外添加7 種維生素，Nancib等[27]也發(fā)現(xiàn)采用廉價氮源部分替代酵母粉，并補充B族維生素，可以獲得較好的發(fā)酵水平，這些研究在獲得廉價原料部分替代酵母粉的同時，都需要額外補充維生素，因此對于降低成本的幅度有限。而本實驗中使用廉價的棉籽餅粉部分替代酵母粉，無需維生素的額外添加，對于降低發(fā)酵培養(yǎng)基的成本效果更為顯著。此外，本研究對培養(yǎng)基中幾種無機鹽濃度進行了考察，確定了最適無機鹽質(zhì)量濃度分別為CH3COONa 3 g/L、KH2PO42 g/L、MnSO40.3 g/L、MgSO40.2 g/L。本研究為L-乳酸發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供了1 株可供選擇的優(yōu)良菌株及其發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組成，若對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，產(chǎn)物L-乳酸的產(chǎn)量還會有提升的空間。

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