剁辣椒發(fā)酵過程中菌群與有機酸變化規(guī)律分析

葉 陵，王晶晶，王蓉蓉，李 勇，劉成國，蔣立文，鄧放明，周 輝,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南省食品科學與生物技術(shù)重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.張家界靈潔綠色食品有限公司，湖南 張家界 427000）

剁辣椒是我國獨具特色的一種發(fā)酵辣椒制品[1]。在目前剁辣椒的工業(yè)化生產(chǎn)中，其生產(chǎn)方式主要是自然發(fā)酵和鹽胚脫鹽發(fā)酵。自然發(fā)酵周期長、生產(chǎn)不穩(wěn)定[2]。鹽胚脫鹽發(fā)酵雖然成本低，加工工藝簡單，但風味、滋味和營養(yǎng)物質(zhì)在較長的貯存期和水洗脫鹽過程中損失嚴重。同時，在發(fā)酵過程中所用的原料、加工方式、環(huán)境條件、氣候條件和菌種不同都會對發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生影響。而采用乳酸菌接種發(fā)酵，不僅縮短發(fā)酵時間，而且加工條件簡單可控，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，是剁辣椒產(chǎn)業(yè)未來的發(fā)展方向[3]。

對自然發(fā)酵剁辣椒中乳酸菌的分離鑒定，表明剁辣椒中的乳酸菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌等，而采用植物乳桿菌進行純種發(fā)酵可以取得比較好的產(chǎn)品品質(zhì)[4-8]。酸味是剁辣椒的一個非常重要的滋味品質(zhì)，其中對酸味起主要作用的有機酸是檸檬酸、乳酸、乙酸等[9]。在蔬菜的自然發(fā)酵過程中，菌群的變化導致產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。如同型發(fā)酵乳酸菌主要產(chǎn)生乳酸，而異型乳酸發(fā)酵可產(chǎn)生乙酸、乙醇等物質(zhì)[10]。乳酸菌利用這些代謝產(chǎn)物，通過丙酮酸激酶等途徑，生成額外的ATP，以提高菌體耐環(huán)境脅迫的能力[11]。

目前關(guān)于剁辣椒發(fā)酵過程中微生物菌群及有機酸變化的研究鮮見報道。因此，本實驗利用課題組前期篩選到的一株發(fā)酵性能優(yōu)良的植物乳桿菌W-4作為發(fā)酵劑菌株進行純種發(fā)酵，以自然發(fā)酵剁辣椒為對照，考察發(fā)酵過程中剁辣椒中微生物菌群及有機酸的變化規(guī)律，為進一步闡明植物乳桿菌在剁辣椒發(fā)酵過程中的作用機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

紅線椒、生姜、大蒜籽均購自湘樺連鎖超市。植物乳桿菌W-4為本課題組前期分離獲得。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責任公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蘋果酸、乙酸、檸檬酸（均為色譜純） 美國Supelco公司；其他試劑（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9272BS-III生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；普光HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器廠；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；雷磁pHs-3C pH計 上海精科儀器有限公司；1510型全波長酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；Avanti J-26XP型高速離心機 美國貝克曼庫爾特公司；WP-UP-WF-20型微量分析超純水機四川沃特爾水處理設備有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀 沃特世（Waters）科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 剁辣椒的制備

工藝路線：

剁辣椒的制備：活化菌株：從斜面挑取植物乳桿菌W-4至MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃活化12 h，重復活化一次。將活化菌液按1%的接種量接種MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；接種細胞懸液制備：將植物乳桿菌W-4的培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min，去上清液，再加入無菌生理鹽水，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為107CFU/mL，密封后放入4 ℃冰箱備用；分別將所有用具（砧板、菜刀、不銹鋼盆、湯匙、筷子和具蓋玻璃瓶）沸水浴10 min殺菌，烘干備用；將紅線椒去蒂、洗凈、自然風干，生姜洗凈去皮，大蒜籽去皮，剁碎備用；按表1中配方稱取原料，先將食鹽、白酒、大蒜籽、生姜和氯化鈣粉末混合均勻，再將上述混合物拌入碎鮮辣椒（紅線椒晾干剁碎制得）中拌勻。分裝密封后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，于發(fā)酵的不同時間點取樣進行檢測。

表1 剁辣椒配料Table 1 Ingredients of chopped pepper

1.3.2 剁辣椒樣品的前處理

將蒸餾水煮沸5～10 min，冷水浴快速降溫備用（煮沸后30 min內(nèi)使用）；稱取剁辣椒樣品30 g，加入蒸餾水30 g，研磨成勻漿。

1.3.3 剁辣椒發(fā)酵過程中pH值的測定

參照GB 10468—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》[12]，于發(fā)酵第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天分別取自然發(fā)酵及植物乳桿菌W-4純種發(fā)酵的剁辣椒樣品，粉碎打漿后用pH計直接測定勻漿的pH值。

1.3.4 剁辣椒發(fā)酵過程中有機酸含量的測定

1.3.4.1 剁辣椒發(fā)酵過程中總酸含量的測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[13]中的方法測定發(fā)酵第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天不同剁辣椒樣品中的總酸含量。

1.3.4.2 剁辣椒發(fā)酵過程中有機酸含量的測定[14-15]

分別稱取發(fā)酵第2天、第4天、第6天、第8天、第10天的自然發(fā)酵及植物乳桿菌W-4純種發(fā)酵的剁辣椒樣品25 g，并加入25 g超純水（放置于4 ℃冰箱過夜以保持較低溫度）混勻；用料理機研磨3 min（勻漿30 s，停15 s循環(huán)6 次）至勻漿完全粉碎（顆粒均勻且粒度?。?；準確稱取2.000 0 g勻漿至50 mL離心管中，再加入約18 g超純水，蓋上離心管蓋，超聲提取30 min（25 ℃），期間振搖3 次使提取完全；稱量離心管質(zhì)量，并加入超純水平衡后，離心（10 000 r/min，15 min，15 ℃）。取上清液至25 mL容量瓶，超純水定容；溶液過0.2 μm親水系微孔膜至2 mL安瓿瓶，分別編號后上機測定有機酸濃度，每個樣品做3 次平行實驗。

標準曲線的繪制：分別取檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸色譜純標準品配制質(zhì)量濃度為500 μg/mL的溶液，再分別稀釋成質(zhì)量濃度為25、50、100、200、300、400 μg/mL的標準溶液。每種質(zhì)量濃度為400 μg/mL的標準溶液取100 μL混勻后過膜，得到每種標準溶液質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的混和標準樣品。

色譜條件：流動相：A：準確稱取磷酸二氫鉀1.360 9 g，加超純水定容至1 L，用磷酸調(diào)至pH值為2.2。再用砂芯過濾裝置真空抽濾溶液過0.20 μm濾膜后備用。B：100%色譜純級甲醇。洗脫方式：等度洗脫（A：97%，B：3%）；流速：0.2 mL/min；進樣體積：1 μL；測量波長：210 nm；柱溫：37 ℃；運行時間：15 min。

1.3.5 剁辣椒發(fā)酵過程中的微生物菌群的檢測

參照GB 4789—2010《食品微生物學檢驗》[16]中霉菌和酵母計數(shù)、菌落總數(shù)測定、大腸桿菌計數(shù)（第二法）、乳酸菌檢驗中的方法進行微生物菌群的測定。

用經(jīng)沸水浴15 min滅菌的藥匙從密封發(fā)酵的分裝玻璃瓶中取樣，分別稱取自然發(fā)酵及植物乳桿菌W-4純種發(fā)酵第2天、第4天、第6天、第8天、第10天的剁辣椒樣品25.0 g，轉(zhuǎn)至盛有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中。劇烈振搖錐形瓶20 min，使樣品中微生物充分分散于溶液體系中；將該溶液進行梯度稀釋，選擇合適稀釋度，分別取1 mL稀釋液轉(zhuǎn)接至無菌平板中，分別倒入融化后的MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、VRBA培養(yǎng)基。PDA平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，其余3 種菌種平板培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果并進行平板計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式剁辣椒發(fā)酵過程中的pH值變化

由圖1可知，在剁辣椒發(fā)酵過程中pH值隨發(fā)酵的進行而降低，2 種剁辣椒的起始pH值均在4.95左右。隨發(fā)酵時間的延長，接種發(fā)酵的剁辣椒pH值逐步降低至4左右并趨于平穩(wěn)，而自然發(fā)酵剁辣椒從發(fā)酵初期開始pH值就呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢，且變化不明顯。原因是接種發(fā)酵接入的植物乳桿菌W-4數(shù)量較大，主導了整個發(fā)酵的過程，因而發(fā)酵產(chǎn)酸速度更快、pH值變化更大。而自然發(fā)酵至12 d pH值依舊未降至4左右，表明其發(fā)酵過程中產(chǎn)酸較慢，發(fā)酵過程慢。pH值的快速降低能有效抑制一些腐敗微生物的生長，提高發(fā)酵蔬菜的安全性[17]。

圖1 剁辣椒發(fā)酵過程中pH值的變化Fig. 1 Change in pH value during the fermentation of chopped pepper

2.2 剁辣椒發(fā)酵過程中總酸含量的變化

圖2 剁辣椒發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig. 2 Change in total acid content during the fermentation of chopped pepper

由圖2可知，在剁辣椒發(fā)酵過程中總酸含量隨發(fā)酵時間的延長而增加，相對而言，接種發(fā)酵的總酸含量變化更明顯，產(chǎn)酸量更大。接種發(fā)酵中總酸含量則是從第0天開始一直呈快速增長趨勢，從第10天開始總酸含量趨于平穩(wěn)。原因是接種發(fā)酵中人工轉(zhuǎn)接了優(yōu)良乳酸菌純菌種，使得瓶內(nèi)乳酸菌初始菌濃度遠高于其他微生物，具有競爭優(yōu)勢。故而發(fā)酵初期乳酸菌能快速增長、產(chǎn)酸使得剁辣椒中總酸含量高于自然發(fā)酵。

2.3 剁辣椒發(fā)酵過程中有機酸的變化規(guī)律

2.3.1 蘋果酸含量的變化

圖3 剁辣椒發(fā)酵過程中蘋果酸含量的變化Fig. 3 Change in malic acid content during the fermentation of chopped pepper

從圖3可以看出，自然發(fā)酵剁辣椒中的蘋果酸含量隨發(fā)酵進程降低緩慢。接種發(fā)酵剁辣椒中的蘋果酸含量隨發(fā)酵進程不斷下降，在第10天時大幅降低。發(fā)酵剁辣椒中蘋果酸含量整體呈現(xiàn)下降趨勢的原因可能是由于蘋果酸可以在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸存在條件下，生成丙酮酸，隨后生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)[18-19]。

2.3.2 檸檬酸含量的變化

圖4 剁辣椒發(fā)酵過程中檸檬酸含量的變化Fig. 4 Change in citric acid content during the fermentation of chopped pepper

由圖4可知，自然發(fā)酵剁辣椒中檸檬酸含量明顯高于接種發(fā)酵。自然發(fā)酵剁辣椒的檸檬酸含量在第6天時達到峰值161.2 μg/g。而接種發(fā)酵中檸檬酸含量則在第8天時達到峰值153.0 μg/g。檸檬酸作為辣椒產(chǎn)生青氣味的主要來源之一，在發(fā)酵熟化過程中會被微生物所代謝。同時，乳酸菌等微生物發(fā)酵也會產(chǎn)生少量檸檬酸，因此造成發(fā)酵過程中檸檬酸含量呈現(xiàn)波動變化。

2.3.3 乳酸含量的變化

圖5 發(fā)酵過程中乳酸含量的變化Fig. 5 Change in lactic acid content during the fermentation of chopped pepper

從圖5可以看出，接種發(fā)酵剁辣椒中乳酸含量隨發(fā)酵時間變化呈不斷上升趨勢，第8～10天增長最為迅速，且整體含量明顯高于自然發(fā)酵剁辣椒。相比較于自然發(fā)酵，接種發(fā)酵由于接入了優(yōu)良乳酸菌，乳酸菌的初始活菌數(shù)遠高于自然發(fā)酵，因而在接種發(fā)酵中乳酸菌能盡早成為優(yōu)勢菌群，代謝營養(yǎng)物質(zhì)并大量產(chǎn)生乳酸。在自然發(fā)酵中，因發(fā)酵時間短，乳酸菌在發(fā)酵環(huán)境中需要與大量其他微生物競爭生長，因此數(shù)量較低，產(chǎn)生的乳酸少。

2.3.4 乙酸含量的變化

通過測定發(fā)酵第2天、第4天、第6天、第8天、第10天時剁辣椒中乙酸的含量時發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵在整個發(fā)酵過程中均未檢出乙酸。而在自然發(fā)酵第2天時，剁辣椒中乙酸含量為（20.21±0.56）μg/g，而在隨后幾個發(fā)酵時間點的樣品中，均未檢出乙酸?？赡艿脑蚴亲匀话l(fā)酵中一些異型發(fā)酵的乳酸菌代謝產(chǎn)生少量的乙酸，隨著發(fā)酵的進行，乙酸可與酵母代謝所產(chǎn)生的醇類等物質(zhì)產(chǎn)生酯化反應，生成了其他的物質(zhì)[20]。而植物乳桿菌作為同型乳酸發(fā)酵乳酸菌，接種發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸含量較自然發(fā)酵要少[21]。

2.4 剁辣椒發(fā)酵過程中的菌群變化規(guī)律

將植物乳桿菌W-4活化發(fā)酵、自然發(fā)酵，置于30 ℃恒溫發(fā)酵。采用稀釋平板法，分別對發(fā)酵第2天、第4天、第6天、第8天、第10天發(fā)酵剁辣椒中的菌落總數(shù)、乳酸菌、真菌（霉菌和酵母菌）和大腸桿菌這4 個微生物指標進行計數(shù)。

圖6 剁辣椒發(fā)酵過程中菌群變化曲線Fig. 6 Change in microflora during the fermentation of chopped pepper

由圖6A和6B可知，自然發(fā)酵和接種發(fā)酵整體的菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)量呈先升后平緩的趨勢。接種發(fā)酵的菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵的整個過程中均高于自然發(fā)酵，這與接入大量植物乳桿菌W-4有關(guān)。接種發(fā)酵從第4天后，菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)量基本趨于穩(wěn)定。自然發(fā)酵則在發(fā)酵第6天后基本維持不變。曲線所呈現(xiàn)的趨勢主要因為在發(fā)酵初期，養(yǎng)分充足，微生物在適應環(huán)境后能快速生長。隨發(fā)酵的不斷進行，微生物代謝所產(chǎn)生的乳酸、乙醇等具有抗菌活性的物質(zhì)，改變了環(huán)境條件，使得菌株生長放緩，微生物數(shù)量逐漸趨于穩(wěn)定。

由圖6C可知，2 種發(fā)酵方式下霉菌、酵母菌（檢出菌株主要是酵母菌）等真菌初始菌種濃度相近，隨發(fā)酵的進行其數(shù)量也在不斷上升。發(fā)酵0～6 d內(nèi)，環(huán)境營養(yǎng)豐富，酸度適宜，霉菌、酵母菌等真菌數(shù)量快速增長。發(fā)酵6～8 d內(nèi)，pH值持續(xù)降低，大量乳酸菌生長均對霉菌、酵母菌有抑制作用，其生長速度減緩。第8天后，隨著pH值進一步降低，環(huán)境對乳酸菌的抑制作用開始顯現(xiàn)，相對受到影響更小的酵母菌則逐步成為優(yōu)勢菌株生長速度再次提升，活菌數(shù)變大直至趨于最大值。

由圖6D可知，大腸桿菌在發(fā)酵初期因為辣椒本身或者用具攜帶使得密封辣椒被少量污染。隨著剁辣椒發(fā)酵不斷進行，乳酸菌會通過代謝產(chǎn)生的乳酸、腌制中的鹽抑制大腸菌群的生長，至發(fā)酵中后期時大腸桿菌已無法檢出[22]。

3 結(jié)論與討論

由于微生物的作用，辣椒在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的有機酸，賦予發(fā)酵辣椒適宜的酸味，同時這些有機酸與其他物質(zhì)相互作用，增加了發(fā)酵辣椒的風味。不同有機酸具有不同的酸味特征，如檸檬酸有爽快的酸味，蘋果酸具有溫和和爽快的酸味，略有苦味，而乳酸的酸味則較為尖利。發(fā)酵辣椒中主要的有機酸為乳酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸等。

接種發(fā)酵產(chǎn)生的總酸含量要高于自然發(fā)酵，但與前人研究結(jié)果相比[23-24]，本研究中總酸及有機酸的測定結(jié)果都偏小，這可能與辣椒原料本身有關(guān)。接種植物乳桿菌W-4發(fā)酵，能加快乳酸發(fā)酵的進程，剁辣椒中乳酸的含量要高于自然發(fā)酵，這與前人的研究結(jié)果一致[25]。相比較于接種發(fā)酵，自然發(fā)酵剁辣椒則具有較高含量的檸檬酸和蘋果酸，在發(fā)酵過程中，檸檬酸與蘋果酸含量的變化規(guī)律不明顯，而接種發(fā)酵中蘋果酸含量呈現(xiàn)下降趨勢，可能與蘋果酸生成丙酮酸參與三羧酸循環(huán)有關(guān)。乙酸只在自然發(fā)酵過程中檢出，而在接種發(fā)酵中并未檢出，可能的原因是乙酸在發(fā)酵剁辣椒中含量本身較低，低含量的乙酸較快地與短鏈的醇類物質(zhì)進行酯化反應，而自然發(fā)酵過程中可能存在異型乳酸發(fā)酵的乳酸菌，生成了乙酸。

對發(fā)酵過程中微生物菌群的研究結(jié)果表明，隨著剁辣椒發(fā)酵不斷進行，大腸桿菌逐漸被抑制，直至消失，這說明剁辣椒具有較高的微生物安全性，這與發(fā)酵蔬菜中的酸度不斷上升有直接的關(guān)系[26]。另外，實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在剁辣椒發(fā)酵過程中，酵母菌也以較高的數(shù)量（約為105CFU/g）與乳酸菌一起生長。有研究表明在四川榨菜和泡菜發(fā)酵過程中，有乳酸菌和酵母菌的共同參與[27-28]，但酵母菌主要存在于泡菜發(fā)酵的前期，隨后逐漸減少直至消失[29]。徐浩等[30]也從高鹽辣椒坯中分離得到1 株耐鹽的魯氏接合酵母，接種發(fā)酵結(jié)果表明高鹽剁辣椒風味良好，色澤紅艷，脆感較好。酵母菌作為發(fā)酵蔬菜中的常見微生物，其代謝產(chǎn)物乙醇等物質(zhì)直接參與了風味物質(zhì)的形成。而在剁辣椒發(fā)酵過程中，酵母菌是否參與了剁辣椒風味品質(zhì)的形成，乳酸菌與酵母菌如何相互作用，其相互作用是否決定了剁辣椒的品質(zhì)，仍不清楚，則需進一步研究酵母菌在剁辣椒品質(zhì)形成中的作用機制。

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