漿水中產(chǎn)香酵母菌菌株的篩選及其增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

姚 博，贠建民*，艾對元，嚴海嬌，白 杰，李多佳

（甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

漿水是我國西北地區(qū)一種傳統(tǒng)發(fā)酵酸性調味食品，一般是用經(jīng)焯水后的蔬菜加入面湯或米湯經(jīng)微生物發(fā)酵制成[1]。其湯汁略呈乳白色，口味酸醇清香，含有豐富的益生菌群[2]，營養(yǎng)價值高，具有清熱解暑、開胃止渴、調理臟腑和降血壓等功效[3-4]，長期以來深受西北人民青睞。

自然發(fā)酵漿水中微生物菌系復雜，其中優(yōu)勢菌群為乳酸菌和酵母菌，賦予了漿水良好的風味[5]。相較于工業(yè)化純種發(fā)酵而言，傳統(tǒng)多菌種混合發(fā)酵工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品味道更優(yōu)、風味更濃，但傳統(tǒng)發(fā)酵過程因受原料、地域、生產(chǎn)規(guī)模和方法等因素的影響，致使?jié){水的風味品質差異較大，且發(fā)酵后期易受霉菌污染[6]，不便于實現(xiàn)工業(yè)化、標準化生產(chǎn)。因此，開發(fā)安全、衛(wèi)生、健康的漿水工業(yè)化產(chǎn)品，是人們的迫切需要。

直投式發(fā)酵菌劑是傳統(tǒng)發(fā)酵食品實現(xiàn)工藝現(xiàn)代化改造過程的關鍵[7]，而篩選獲得產(chǎn)香性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株是開發(fā)直投式發(fā)酵菌劑的基礎。目前，漿水的研究主要集中在漿水發(fā)酵工藝研究[8-9]、微生物的分離鑒定[5-6]及其亞硝酸鹽的變化[3,10]等方面，對于漿水中優(yōu)良功能菌株的篩選研究報道甚少。根據(jù)本實驗室多年的研究，漿水中的特征香氣成分為檸檬烯、乙酸乙酯、乙醛、蒎烯、苯乙醇、正己醇和乙酸，這些香氣物質主要來自于發(fā)酵過程微生物的代謝作用[11]。為此，本研究擬通過篩選漿水中產(chǎn)香性能優(yōu)良的酵母菌菌株，并優(yōu)化其增殖培養(yǎng)基，旨在為開發(fā)漿水輔助發(fā)酵直投式菌劑及實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供產(chǎn)香菌種來源和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

漿水由甘肅天水孟姑漿水廠提供。

環(huán)己酮（色譜純） 美國Sigma Aldrich公司；酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂 北京奧博星生物技術有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

酵母菌分離培養(yǎng)基（yeast extract-peptone-dextrose，YEPD）：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母菌液體培養(yǎng)基（yeast extract-peptone-dextrose broth，YPB）：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

豆芽汁培養(yǎng)基：豆芽汁（10%）100 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基：將大麥芽粉碎，麥芽粉與水的比例為1∶4（g/mL），38 ℃保溫2 h，升溫至45 ℃，30 min，再提高到50℃，30 min，再升華至60 ℃，糖化1～1.5 h至完全糖化，并用雞蛋清煮沸澄清，稀釋至適當濃度，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，酵母膏1g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；101-1-S-II電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；TRACE 1310氣相色譜儀、TG-WAX色譜柱 美國Thermo Scientific公司；頂空固相微萃取裝置（DVB/CAR/PDMS萃取器） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)香酵母菌菌株的篩選

1.3.1.1 酵母菌菌株的分離

吸取10 mL漿水于已滅菌的裝有90 mL無菌生理鹽水的500 mL三角瓶中，充分搖勻，制備菌懸液，梯度稀釋至10-7，吸取稀釋液0.1 mL均勻涂布在已滅菌的YEPD固體平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。取菌落密度適中的平板，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進行劃線分離[12]。

1.3.1.2 產(chǎn)香酵母菌菌株的篩選

分別挑取1環(huán)純化后的酵母菌菌種接種于50 mL/150 mL 10 °Be′麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1～5 d。

由10 位身體健康，無不良嗜好、偏食和變態(tài)性反應的同學組成評價小組，對發(fā)酵后的酵母菌培養(yǎng)液持續(xù)每日進行外觀及氣味的評價，綜合評價，挑選出產(chǎn)香氣良好、持續(xù)時間長、無不良氣味的幾株酵母菌菌株[13]。同時對其發(fā)酵殘?zhí)橇?、生物量和揮發(fā)性成分進行測定優(yōu)選產(chǎn)香酵母菌。

1.3.2 發(fā)酵性能檢測

殘?zhí)橇繙y定：采用3,5-二硝基水楊酸法[14]。生物量測定：采用質量恒定法[15]。產(chǎn)香性能測定：采用半定量頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solidphase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HSME-GC-MS）聯(lián)用技術對酵母菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物進行揮發(fā)性成分測定，以滅菌后不接菌培養(yǎng)基在同等條件培養(yǎng)后作為對照。

萃取條件：在裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入10 mL發(fā)酵液，并加入1 g NaCl和16 μL/mL的10 μL環(huán)己酮，40 ℃恒溫攪拌30 min，將已老化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，吸附30 min，進樣口溫度250 ℃，解吸10 min。

GC條件：TG-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣，流量1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至180 ℃，保留10 min。

MS條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，電子電離源，電子能量70 eV，掃描質量范圍50～450 u。經(jīng)計算機在Nist及Wiley標準譜庫的檢索對比，通過計算機相應的保留指數(shù)對比，匹配度大于700（最大值為1 000）進行確認。

內標法[16]（假定各組分的響應因子為1）計算公式為：mi=（ms/As）×Ai。其中mi為組分的質量；ms為內標物的質量；Ai為組分的峰面積；As為內標物的峰面積。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

根據(jù)《酵母菌特性及鑒定手冊》[17]，對該菌株進行菌體形態(tài)，包括子囊孢子、擲孢子、假菌絲的觀察，及糖發(fā)酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化實驗、類淀粉化合物生成、硝酸鹽利用、脲酶實驗等生理生化鑒定。

1.3.3.2 分子生物學序列鑒定

將提取的基因組DNA委托北京奧維森生物科技有限公司對26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因進行序列擴增。得到的26S rDNA D1/D2區(qū)序列結果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，所得基因序列通過BLAST程序提交，NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列檢索，將目標菌株和應用BLAST檢索到的與之較高的同源性菌株的26S rDNA中D1/D2區(qū)域基因序列作最大同源性比較分析[18]。

1.3.4 酵母菌菌株增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.4.1 增殖基礎培養(yǎng)基的篩選

挑取1 環(huán)斜面活化的酵母菌接種到10 mL YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，制成酵母富集液，用無菌水稀釋至約10-5的菌懸液，4 ℃保藏備用。

分別配制10 °Be′麥芽汁培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基、YPB培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、酵母基礎培養(yǎng)基，接種3%菌懸液于各培養(yǎng)基（30 mL/150 mL）中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測定各培養(yǎng)基中的細胞濃度。分別配制4、6、8、10、12、14 °Be′的麥芽汁培養(yǎng)基，同上述條件，測定各培養(yǎng)基中的細胞濃度。細胞濃度測定采用血球計數(shù)板法[19]。

1.3.4.2 生長曲線的測定

吸取3%的菌懸液接種于30 mL/150 mL的麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定細胞濃度[20]。

1.3.4.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

在裝液量30 mL/150 mL、接種量3%、28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)20 h后，以發(fā)酵液中的細胞濃度為優(yōu)選指標，對麥芽汁培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

以篩選出的麥芽汁培養(yǎng)基為對照，在其基礎上添加10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉篩選最佳碳源；添加5、10、20、30、40、50 g/L的葡萄糖篩選最適糖質量濃度；在最佳碳源的基礎上添加0.5 g/L氮元素的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素、硝酸鉀篩選最佳氮源；添加1、2、3、4、5、6 g/L的牛肉膏篩選最適氮源質量濃度；在最佳碳源和氮源基礎上，添加0.5 g/L的KH2PO4、NaCl、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CaCl2篩選最佳無機鹽種類，添加0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g/L的KH2PO4篩選最適無機鹽質量濃度[21]。

在單因素試驗結果的基礎上，選取葡萄糖、牛肉膏、KH2PO4質量濃度為考察因素，使用Design-Expert對各因素進行中心組合響應面設計，以細胞濃度為響應值，以期得到最優(yōu)培養(yǎng)基組合。

1.3.4.4 Y16菌株在優(yōu)化增殖培養(yǎng)基中產(chǎn)香能力的GC-MS檢測

為進一步檢驗優(yōu)選菌株增殖后的產(chǎn)香能力，采用同1.3.2節(jié)方法，對其在最佳增殖培養(yǎng)基上發(fā)酵后的乙酸乙酯及檸檬烯含量進行測定。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

2.1.1 感官評定結果

從漿水中分離篩選出16 株酵母菌，編號為Y1～Y16，分別接種于10 °Be′麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1～5 d。發(fā)酵期間對酵母菌發(fā)酵液持續(xù)每日進行外觀及氣味的評價，綜合評價結果見表1。

由表1可以看出，分離出的16 株酵母菌發(fā)酵液的感官風味特征各異，其中Y3、Y5、Y12、Y15和Y16共5 株酵母菌菌株不產(chǎn)生褐變，產(chǎn)果香持久、濃郁，風味良好；Y2、Y4、Y7、Y9、Y10和Y11共6 株酵母菌產(chǎn)生較淡的果香味，無明顯異味，其中Y9發(fā)酵第3天后發(fā)生褐變；Y6、Y13發(fā)酵前期產(chǎn)生香味，第3天后出現(xiàn)不良風味；Y1發(fā)酵過程中出現(xiàn)不良風味；Y8發(fā)酵中輕微褐變，香味不突出；Y14發(fā)酵中無褐變，無明顯香味和異味。綜上，Y3、Y5、Y12、Y15和Y16共5 株酵母菌株產(chǎn)香味持久濃郁，產(chǎn)香性能突出，發(fā)酵過程中無不良風味，故選作產(chǎn)香初篩菌株。

2.1.2 5 株初篩酵母菌發(fā)酵過程殘?zhí)橇考吧锪孔兓?/p>

圖1 發(fā)酵過程中5 株酵母菌殘?zhí)橇康淖兓疐ig. 1 Change in residual sugar during fermentation of 5 selected yeasts

圖2 發(fā)酵過程中5 株酵母菌生物量的變化Fig. 2 Change in biomass during fermentation of 5 selected yeasts

酵母菌利用糖的能力越高，其生長活力旺盛，發(fā)酵性能、物質轉化能力就越強。其產(chǎn)生的相應風味物質也就越多。由圖1可看出，Y5、Y12、Y15和Y16菌株隨著發(fā)酵時間的延長，殘?zhí)橇恐鸩浇档?，且降低程度較快，說明對糖的利用速率較快，發(fā)酵能力較好，而Y3菌株發(fā)酵能力相對較弱。由圖2可看出，5 株酵母菌的生物量增速均較快，在24 h后基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，其中Y12和Y16菌株的生物量最高。

2.1.3 5 株酵母菌發(fā)酵過程產(chǎn)揮發(fā)性成分測定結果

圖3 5 株酵母菌菌株的GC-MS總離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of GC-MS for volatile compounds produced by five yeasts

由圖3可以得出，初篩的5 株酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物中均含有較高的漿水主體香氣物質乙酸乙酯（出峰時間6.4 min），其中Y12菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量最高，為226.76 μg/mL，Y16菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量次之，為204.45 μg/mL，且該菌株產(chǎn)檸檬烯（出峰時間14.07 min）的含量也達到0.063 μg/mL。由于檸檬烯和乙酸乙酯是漿水中最主要的兩種主體風味物質，對漿水風味貢獻率最大[11]，故Y16菌株的發(fā)酵產(chǎn)物風味更接近于傳統(tǒng)自然發(fā)酵漿水特有的風味。

鑒于Y16酵母菌菌株的糖利用速率快、菌體生物量高，且其發(fā)酵產(chǎn)物中含有較高的漿水中的主體風味檸檬烯和乙酸乙酯，故確定Y16酵母菌菌株為漿水發(fā)酵的優(yōu)良產(chǎn)香菌株。

2.2 菌株鑒定結果

2.2.1 菌株形態(tài)學及生理生化鑒定結果

固體培養(yǎng)特征：菌落小，灰白色，圓屋頂狀，半透明，表面平滑，邊緣整齊，黏稠。

液體培養(yǎng)特征：澄清，后期有白色沉淀，有菌璞。

根據(jù)《酵母菌特性及鑒定手冊》，對Y16酵母菌菌株進行了生理生化鑒定，結果如表2所示。通過對比，該菌株與異常漢遜酵母菌（Hansenula anomala）很相似。

表2 Y16菌株的生理生化實驗結果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain Y16

2.2.2 菌株分子生物學鑒定結果

對篩出的Y16菌株進行26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因序列分析鑒定，取其基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，結果如圖4所示。

圖4 Y16菌株的PCR電泳圖Fig. 4 Electrophoregram of PCR amplified genomic DNA from strain Y16

Y16酵母菌26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因PCR擴增產(chǎn)物均在500～600 bp之間，結果提交GenBank，得知該條帶大小為590 bp（登錄號FJ972217），提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對，與Wickerhamomyces anomalus同源性為99.9%，結合菌落形態(tài)和生理生化特征鑒定，確定Y16為異常漢遜酵母。

2.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化結果

2.3.1 基礎培養(yǎng)基的篩選結果

圖5 不同基礎培養(yǎng)基對Y16生長的影響Fig. 5 Effect of different basic media on on the growth of Y16

圖6 麥芽汁培養(yǎng)基濃度對Y16生長的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of wort medium the growth of Y16

由圖5可知，Y16菌株均能利用麥芽汁、豆芽汁、YPB、PDB培養(yǎng)基生長，其中基礎培養(yǎng)基麥芽汁的細胞增殖效果最好，細胞濃度達到1.99×108個/mL，因此選擇麥芽汁培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基。由圖6可知，隨著麥芽汁濃度的增大，細胞濃度呈先上升后下降的趨勢，說明麥芽汁濃度過高，會抑制酵母菌的生長，故選擇10 °Be′的麥芽汁培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基。

2.3.2 Y16菌株生長曲線測定結果

圖7 Y16菌株生長曲線Fig. 7 The growth curve of Y16 strain

由圖7可知，Y16菌株在培養(yǎng)6 h后，進入對數(shù)期，18 h達到對數(shù)生長末期；20 h進入穩(wěn)定期，細胞濃度達到最大。為使菌體的總生長量和活性達到最大，故選擇20 h時間點作為菌體收集點。

2.3.3 Y16菌株增殖培養(yǎng)基優(yōu)化結果

2.3.3.1 碳源種類及碳源質量濃度對Y16菌株細胞濃度的影響

圖8 碳源種類對Y16生長的影響Fig. 8 Effect of different carbon sources on the growth of Y16

圖9 葡萄糖質量濃度對Y16生長的影響Fig. 9 Effect of different glucose concentrations on the growth of Y16

碳源是化能異養(yǎng)型微生物代謝所需的能量來源，選擇適合的碳源對提高微生物的繁殖速度和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是非常關鍵的[22]。乙酰輔酶A是酵母菌體內合成檸檬烯及乙酸乙酯的起點[23-24]，而乙酰輔酶A可由葡萄糖降解而來，所以增加適量的糖有助于提高乙酸乙酯和檸檬烯的含量。由圖8可知，Y16菌株均能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉進行生長繁殖，其中利用葡萄糖細胞濃度增長最快。由圖9可知，隨著葡萄糖質量濃度的增長，Y16菌株生長越緩慢，說明高質量濃度的糖不利于微生物生長，添加葡萄糖質量濃度為10 g/L時，細胞濃度達到最大，為3.743×108個/mL，故選擇添加10 g/L的葡萄糖作為補充碳源。

2.3.3.2 氮源種類及氮源質量濃度對Y16菌株細胞濃度的影響

氮是組成核酸和蛋白質的重要元素，微生物提供合成細胞物質代謝產(chǎn)物的原料[25]，微生物在含有有機氮源的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出生長旺盛，細胞濃度增長速度快，并有利于積累代謝產(chǎn)物。由圖10可知，增加供試的6種氮源均有利于Y16菌株的生長，其中利用牛肉膏生長繁殖最快。由圖11可知，添加牛肉膏質量濃度在2 g/L時，最有利于Y16菌株的生長，細胞濃度達到6.783×108個/mL，故選擇2 g/L的牛肉膏作為補充氮源。

圖10 氮源種類對Y16生長的影響Fig. 10 Effect of different nitrogen sources on the growth of Y16

圖11 牛肉膏質量濃度對Y16生長的影響Fig. 11 Effect of different beef extract concentrations on the growth of Y16

2.3.3.3 無機鹽種類及KH2PO4質量濃度對Y16菌株細胞濃度的影響

圖12 無機鹽種類對Y16生長的影響Fig. 12 Effect of different salt species on the growth of Y16

圖13 KH2PO4質量濃度對Y16生長的影響Fig. 13 Effect of different KH2PO4 concentrations on the growth of Y16

由圖12可知，供試的6 種無機鹽均有利于Y16菌株的生長，其中KH2PO4最有利于Y16菌株細胞濃度的增長。已有文獻報道表明，磷酸鹽對酵母的生長及代謝均極為重要，培養(yǎng)基中添加一定量的磷酸鹽，對產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯有利[26]。由圖13可知，在KH2PO4質量濃度為0.7 g/L時，細胞濃度達到最大，為8.017×108個/mL，故選擇0.7 g/L的KH2PO4作為補充無機鹽。

2.3.3.4 響應面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基結果

根據(jù)單因素試驗結果，在10 °Be′麥芽汁基礎培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖10 g/L、牛肉膏2 g/L、KH2PO40.7 g/L，細胞濃度具有最大值。因此使用Design-Expert對培養(yǎng)基條件進行中心組合響應面試驗分析，以細胞濃度為響應值，設計及優(yōu)化結果如表3所示。

表3 響應面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基試驗結果Table 3 Experimental design with response variable for response surface analysis

經(jīng)二次多項回歸擬合，得到培養(yǎng)液中以細胞濃度為響應值的回歸方程：

Y=8.661 734+0.358 664A+0.388 513B+0.344 273C-0.590 5AB+0.36AC+0.580 5BC-0.824 556A2-0.923 555B2-0.700 816C2

表4 響應面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基回歸模型參數(shù)檢驗Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

根據(jù)表4方差分析可看出，該模型優(yōu)化Y16菌株培養(yǎng)基在α為0.01的水平上效果顯著，回歸方程失擬項檢驗不顯著（P＞0.05），其決定系數(shù)R2為0.961 2，表明該擬合方程與實際相符，誤差較小，能較好地反映各因素與響應值的之間的關系，可以確定其培養(yǎng)基優(yōu)化配方。其中，A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2因素對Y16菌株細胞濃度的影響極顯著（P＜0.01），AC因素對Y16菌株細胞濃度增長的影響顯著（P＜0.05）。由各因素對試驗指標的影響程度F值可以看出，牛肉膏對該菌株的細胞濃度增長影響最大，葡萄糖的影響次之，KH2PO4的影響最小。

由圖14a可知，響應面曲面坡度陡峭且等高線扁而密集，說明添加的葡萄糖和牛肉膏兩因素交互作用對Y16菌株細胞濃度有極顯著影響；由圖14b可知，響應面曲面坡度陡峭度降低，等高線較密集，說明添加的葡萄糖與KH2PO4兩因素的交互作用對Y16菌株細胞濃度影響顯著；由圖14c可知，響應面曲面坡度陡峭，等高線密集，說明添加的牛肉膏與KH2PO4兩因素的交互作用對Y16菌株細胞濃度影響極顯著。

2.3.3.5 最優(yōu)培養(yǎng)基配方確定及驗證

通過對回歸模型進行數(shù)學分析，得到Y16菌株在10 °Be’麥芽汁基礎培養(yǎng)基上最佳的營養(yǎng)物添加量為葡萄糖11.05 g/L、牛肉膏2.27 g/L、KH2PO40.782 g/L，細胞濃度達到8.82×108個/mL。但為提高實際可操作性，根據(jù)以上響應面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基結果，優(yōu)化最佳的營養(yǎng)物添加量為葡萄糖11.0 g/L、牛肉膏2.3 g/L、KH2PO40.8 g/L，得到細胞濃度為8.8×108個/mL。在此添加量培養(yǎng)基的條件下，重復實驗3 次，得到細胞濃度為8.75×108個/mL，與理論預測值相比，其相對誤差為0.57%。說明該模型設計準確可靠，得到的最佳添加量可行，在實際操作中具有指導意義。

2.4 Y16菌株在優(yōu)化增殖培養(yǎng)基中產(chǎn)香能力的GC-MS檢測結果

表5 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化前后乙酸乙酯與檸檬烯產(chǎn)量的變化Table 5 Comparative production of ethyl acetate and limonene in optimized and initial medium

由表5可知，對Y16菌株進行增殖培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)后，乙酸乙酯的產(chǎn)量同比發(fā)酵初始培養(yǎng)基增加了25.39%，檸檬烯增加了31.75%，增香效果顯著。

3 討論與結論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品獨特風味形成都與產(chǎn)香功能菌的代謝產(chǎn)物密切相關[27]。如Jung等[28]研究泡菜發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)Leuconostoc mesenteroides是主要功能乳酸菌，將其應用于發(fā)酵可以很好地改善產(chǎn)品的風味。Jansen等[29]發(fā)現(xiàn)魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）在醬油發(fā)酵前期生長繁殖，其發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等成分生成乙醇、甘油、琥珀酸及其他微量成分，并與嗜鹽片球菌聯(lián)合作用生成糠醇，使醬油具有特殊的香氣。Viana等[30]研究非釀酒酵母在釀造過程中能夠產(chǎn)生特殊的酯香味物質或產(chǎn)生不同的高級醇，形成黃酒的特殊風味?？梢姽δ芫Y選對研究食品風味具有重要意義，而目前針對漿水中具有產(chǎn)香功能菌的菌株研究甚少。

酵母菌活動生成乙醇，經(jīng)酯化反應生成酯類、醇類、醛類等芳香物質，這些物質構成發(fā)酵食品的特征風味成分[31]。Ciani等[32]研究釀酒酵母在15 ℃采用順序發(fā)酵的方法獲得乙酸乙酯的高產(chǎn)量，乙酸乙酯是由酵母菌代謝產(chǎn)生，本研究也得到相似的結果，異常漢遜酵母能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的乙酸乙酯。

本研究以甘肅傳統(tǒng)釀制的漿水為材料，采用經(jīng)典平板分離法分離出了16 株酵母菌菌株，篩選出一株產(chǎn)香性能優(yōu)良的酵母菌菌株，經(jīng)鑒定為異常漢遜酵母。優(yōu)化得到該菌株的增殖培養(yǎng)基配方為：10 °Be′麥芽汁，其中最佳的營養(yǎng)物添加量分別為葡萄糖11.0 g/L、牛肉膏2.3 g/L、KH2PO40.8 g/L，細胞濃度可達到8.75×108個/mL，是初始麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基細胞濃度的4 倍多。同時該菌株可以生成乙酸乙酯和檸檬烯這兩種漿水傳統(tǒng)釀制中的特征風味物質，其中，乙酸乙酯的產(chǎn)量達到256.35 μg/mL，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基增加了25.39%；檸檬烯的產(chǎn)量達到0.083 μg/mL，比優(yōu)化前增加了31.75%，增香效果明顯。所以對該菌株的開發(fā)利用是非常必要的，可為漿水發(fā)酵直投式增香菌劑的開發(fā)提供菌株來源和技術參考。

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