IgA腎病常用實驗動物模型和中西醫(yī)治療概況*

楊佳敏，唐 英

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科 (上海200021)

主題詞 腎病/中西醫(yī)結(jié)合療法 免疫球蛋白A 模型，動物

A免疫球蛋白腎病(IgA nephropathy,IgAN)是最常見的原發(fā)性腎小球疾病,1968年首次由法國人J Berger和N Hinglais報道,也稱為Berger病。IgAN以腎臟病理檢查在腎小球系膜區(qū)有以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積為基本特點。在我國IgAN是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎,雖病情進展緩慢，但仍有30%～40%的患者在明確診斷后20～30年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病( ESRD)[1]。目前IgAN發(fā)病機制未完全明確，國內(nèi)外常以應(yīng)用腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiontensin system,RAS)受體阻滯劑為主要治療方式用以降壓、減少蛋白尿和保護腎功能，效果不明顯可以加用激素或免疫抑制劑。IgAN在我國古代醫(yī)籍中未有準(zhǔn)確病名記載，但“血尿”、“尿濁”、“水腫“、“腰痛”等病癥的臨床證候與IgAN有眾多相似之處。IgAN多發(fā)生在人體正虛之時，或感受外邪、或損傷脾胃，氣血失和，濕熱內(nèi)聚，瘀血阻絡(luò)，血絡(luò)損傷而致病，多認(rèn)為IgAN的發(fā)生發(fā)展與正氣虛損、感受“風(fēng)、寒、濕”邪密切相關(guān)。中醫(yī)藥常用利水消腫、健脾益氣、補腎培元、活血化瘀、祛濕化濁等扶正祛邪方式減少血尿、蛋白尿，臨床治療具有明顯優(yōu)勢。但中醫(yī)藥治療IgAN血尿、蛋白尿機制并不十分明確，因此建立和誘導(dǎo)理想的動物模型對探索IgAN發(fā)病機制及疾病診斷治療具有重要的意義。目前國際常用的動物疾病模型建立方式大致有免疫誘導(dǎo)型、繼發(fā)病變型和自發(fā)病變型，本文現(xiàn)將這些建模的方法進行綜述。

1免疫誘導(dǎo)型IgA腎病(IgAN)是腎小球系膜區(qū)以IgA或IgA沉積為主的原發(fā)性腎小球疾病，典型病理表現(xiàn)為免疫熒光可檢測到IgA和C3在系膜區(qū)沉積，同時可伴有IgG和(或)IgM沉積[3]。目前多認(rèn)為人血清中IgA中分為IgA1和IgA2兩種亞型，而IgA1分子沉積在腎小球系膜區(qū)成為導(dǎo)致IgAN的主要原因。眾多學(xué)者已經(jīng)證實IgA1分子鉸鏈區(qū)O-聚糖存在半乳糖缺陷，這種半乳糖基化的IgA1沉積于腎小球系膜區(qū)可能有致病作用。基于IgAN的病理特點，在實驗中利用微生物或者異種蛋白免疫誘導(dǎo)動物模型方法得到廣泛推廣。

1.1 微生物誘導(dǎo)型模型:通過收集IgAN臨床資料發(fā)現(xiàn)，49.4%的IgAN患者有先驅(qū)感染，或因感染加重病情[7]。有研究證實呼吸道(和)或消化道黏膜感染會損傷粘膜免疫系統(tǒng)，免疫復(fù)合物IgA由B細(xì)胞分泌，在抗原刺激下，黏膜免疫系統(tǒng)激活使IgA抗原進入血液引起機體免疫反應(yīng)，導(dǎo)致以IgA1為主的免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū)誘發(fā)IgAN。劉志紅等證實細(xì)菌腸毒素能造成粘膜免疫反應(yīng)異常使IgA沉積于腎組織；后其團隊在原研究基礎(chǔ)上用甲醛化的空腸彎曲桿菌毒素灌喂大鼠，病理顯示大鼠腎臟系膜區(qū)形成IgA沉積提示造模成功。韓長松、張磊等在其課題組之前建立的模型之上進行改進，通過隔周在小鼠頸背部皮下注射含有20肽的麥芽糖結(jié)合蛋白與弗氏不完全佐劑，進行21周后利用金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜20肽成功誘導(dǎo)IgAN動物模型，改進后的IgAN小鼠模型腎炎相關(guān)癥狀更典型，腎臟病理分析與人IgAN有更強的相似性。在此之前，Sharmin等利用金葡菌的細(xì)胞膜抗原免疫小鼠成功誘導(dǎo)IgAN模型。Yamamoto等給小鼠口服和腹腔注射副流感嗜血桿菌30周后成功誘導(dǎo)IgAN模型，小鼠腎臟病理顯示在系膜區(qū)出免疫復(fù)合物IgA沉積,同時表現(xiàn)出IgAN相關(guān)癥狀，闡釋副流感嗜血桿菌可能引起IgAN。還有學(xué)者利用仙臺病毒誘發(fā)動物IgAN。

利用微生物誘導(dǎo)IgAN動物模型取得了一定成功，但實際誘導(dǎo)的動物模型雖然在腎臟病理與人類疾病非常相似，但蛋白尿、血尿、水腫等臨床表現(xiàn)差異較大；并且仙臺病毒在自然界為小鼠易感菌，但在人類感染中十分罕見，故此種誘導(dǎo)方法對臨床診斷和治療指導(dǎo)性較差。利用微生物誘導(dǎo)IgAN動物模型，雖然為臨床診斷和研究工作提供了新思路，但因為可重復(fù)性差、成本較高、操作要求程度高等原因，在實際研究工作中使用率較低。

1.2 免疫復(fù)合物誘導(dǎo)型模型：1979年Rifai等首次用來源于MOPC-315雜交瘤的Anti-DNP(二硝基苯酚)與DNP化的牛血清白蛋白制成免疫復(fù)合物通過靜脈注射至Balb/c鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟系膜區(qū)有免疫復(fù)合物沉積。在20世紀(jì)80年代早期，Isaacs等給小鼠注射一種化學(xué)變性的多聚糖(右旋糖酐)后成功誘發(fā)小鼠IgAN，小鼠臨床和病理都符合IgAN表現(xiàn)。金曉明等經(jīng)尾靜脈將葡聚糖G200注入昆明小鼠體內(nèi)后動物出現(xiàn)蛋白尿、血尿等表現(xiàn)，腎臟系膜區(qū)有IgA沉積，且與人IgAN的病理變化更相近，說明葡聚糖G200誘導(dǎo)IgAN小鼠獲得成功。

利用免疫復(fù)合物誘導(dǎo)動物IgAN模型成本較高，但成功率較低，且有研究顯示利用免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的動物模型在動物肝臟和脾臟有淀粉樣的沉積，說明造模所用試劑和藥物對動物肝臟和脾臟功能有一定的影響，可能對造模結(jié)果以及后續(xù)的實驗結(jié)果有一定影響，故在實驗中如何改進建模方法減少其他臟器的損傷、增加實驗結(jié)果的可信度有待于加強。

1.3 異種蛋白型模型：我國常用的動物模型建立方法為大鼠(或小鼠)牛血清白蛋白(BSA)口服，同時通過尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素(SEB)復(fù)合法。多認(rèn)為口服BSA會造成IgA蓄積于體內(nèi)，特別是蓄積在腎臟系膜區(qū)誘發(fā)IgAN；SEB可以破壞肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，而肝損傷易導(dǎo)致IgA清除減少而沉積于腎臟。張靜等用BSA以 400 mg/kg劑量隔天灌胃持續(xù)12周、蓖麻油0.3 ml+四氯化碳0.10 ml皮下注射,每周1次，持續(xù)1周，并于第8周尾靜脈注射脂多糖(LPS)0.05 mg成功建立IgAN模型。后其課題組在此基礎(chǔ)上在其他藥物用法用量不變的基礎(chǔ)上將BSA劑量增加至600 mg/kg,病理顯示腎臟損害進一步加重。陸慧瑜等改良IgA腎病大鼠模型，BSA以400 mg/kg劑量隔天灌胃8周，四氯化碳和蓖麻油用量不變，將用藥時間增加至9周；并在6周時尾靜脈注射0.05 mg脂多糖(LPS)，誘導(dǎo)后動物病理和臨床表現(xiàn)與人類表現(xiàn)接近。王麗娜等BSA用量增加至600 mg/kg灌胃持續(xù)12周，皮下注射用藥和用量與陸慧瑜的方案相同但免疫時間改為每周一次并持續(xù)12周，LSP注射時間改為第8周后造模成功。也有研究將BSA濃度降至200 mg/kg隔日灌胃，從第6周開始每日以20 mg/kg劑量尾靜脈注射1%BSA(1gBSA溶于1250 ml注射用水中配成BSA為0.4 mg/0.5ml溶液)連續(xù)3 d,第8周按0.5 mg/kg尾靜脈注射SEB(0.01 mg/0.5 ml濃度)每周一次連續(xù)注射3周至12周末成功誘導(dǎo)IgA腎病動物模型，這種方法相比未用四氯化碳和蓖麻油進行腹腔注射的方法不僅能減少四氯化碳等對腹腔的感染，還可以減少SEB對機體傷害。

上述常用的異種蛋白復(fù)合建立的動物模型造模方法簡便易行，常規(guī)利用BSA口服+四氯化碳和蓖麻油皮下注射+LPS尾靜脈注射復(fù)合誘導(dǎo)法，免疫時間相對較短，所選用的藥物和藥物劑量相對于動物臟器和腹腔引發(fā)的感染較少，動物死亡率較低，保證實驗順利進行。同時，所誘導(dǎo)的動物臨床表現(xiàn)和病理結(jié)果與人類IgAN相近，為研究人類IgAN發(fā)病機制和臨床治療奠定了良好的基礎(chǔ)。這種造模方式方法簡便、造價較低、成功率高，在實際應(yīng)用中得到改良和推廣。

2繼發(fā)性動物模型繼發(fā)性IgAN主因其他器官組織原發(fā)疾病發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物IgA沉積在腎臟系膜區(qū)繼發(fā)造成腎臟病變，常發(fā)生于過敏性紫癜、酒精性肝炎，慢性乙型肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，故可以通過減少體內(nèi)IgA的清除促使其在體內(nèi)特別是腎臟沉積來誘發(fā)IgAN從而建立IgAN模型。有研究表明肝kupffer細(xì)胞功能受損時可以導(dǎo)致IgA循環(huán)免疫復(fù)合物清除減少而在體內(nèi)蓄積,故常通過藥物對動物肝臟造成損傷使IgA在肝臟清除減少導(dǎo)致IgA在腎臟沉積誘發(fā)IgA腎病。1988年章友康等通過部分肝切除使模型動物血清中IgA水平升高。有實驗給動物腹腔注射CCL4的方法來造成肝硬化以誘發(fā)IgAN，但可能造成肝臟形成假小葉、肝臟細(xì)胞嚴(yán)重壞死。

目前常用的繼發(fā)性動物模型利用肝切除或者CCL4造成動物肝功能不全以誘發(fā)IgAN。但這種方法對動物肝臟損傷較大，動物的臨床和病理表現(xiàn)與人類相差較大，故在實際運用中并不常見。有研究顯示，LPS可以直接對肝臟造成損傷，也可能激活免疫系統(tǒng)而對肝臟造成損傷,在異種蛋白免疫型動物模型中常以BSA400 mg/kg隔天灌胃加用蓖麻油0.3 ml+四氯化碳0.10 ml皮下注射，第八周LSP0.05 mg尾靜脈注射聯(lián)合造模，此種方法對動物肝臟和腹腔損傷較小。

3自發(fā)病變型動物模型自發(fā)病變型是通過純系動物或者轉(zhuǎn)基因動物自身帶有的IgAN的易感性通過多代繁殖交配而產(chǎn)生自身免疫缺陷的動物。在1920年前ddY小鼠從德國引進并飼養(yǎng)于日本，直到1985年Imai等第一次提出ddY小鼠可以作為研究人類IgA腎病的動物模型。ddY小鼠自發(fā)在20周表現(xiàn)出微量蛋白尿，但未表現(xiàn)出血尿，隨著血清IgA水平的升高，在腎臟系膜區(qū)有IgA沉積。但ddY小鼠IgA腎病發(fā)病的時間和程度不盡相同，有研究根據(jù)ddY小鼠發(fā)病時間分為3組，大約有早發(fā)性35%在20周左右發(fā)病，有約35%小鼠為遲發(fā)組，在0～40周發(fā)病，還有大約30%ddY小鼠為靜止組，大約至60周在腎臟有IgA沉積。為了減少ddY小鼠發(fā)病時間和腎臟損傷程度的差異，將高血清ddY小鼠通過近親交配培育出高血清IgA小鼠(High serum IgA mice,HIGA小鼠)，這種小鼠較ddY小鼠更早出現(xiàn)IgAN相關(guān)表現(xiàn)，即在培育12代后10周齡大約有10%小鼠會有蛋白尿，25周在腎臟有IgA沉積。在HIGA小鼠的基礎(chǔ)上，為了避免HIGA 小鼠遺傳的特異性以及發(fā)病時間的多變性，Okazaki等針對ddy小鼠發(fā)病較晚的問題，利用早發(fā)病型的ddY小鼠近親交配至20代以上，小鼠在8周出現(xiàn)蛋白尿，并于24周血肌酐開始升高，伴隨系膜區(qū)IgA的沉積，成功復(fù)制出早期發(fā)病的ddY小鼠模型(Grouped ddY mice，gddY小鼠)。gddY小鼠不僅出現(xiàn)蛋白尿時間更早，而且會出現(xiàn)腎功能損傷，與人類IgA腎病的臨床和病理表現(xiàn)更為相近，有更加廣闊的研究空間。

自發(fā)病變型小鼠的出現(xiàn)，為人類研究IgAN的發(fā)病機制以及相關(guān)基因變異提供了新的思路和方式，但自發(fā)病變型小鼠發(fā)病時間和腎臟病損不同，有研究發(fā)現(xiàn)所有ddY雌性小鼠在第8周出現(xiàn)蛋白尿，在24周出現(xiàn)血肌酐升高而腎衰竭，HIGA小鼠血清IgA水平與8周齡ddY小鼠相比更高但未出現(xiàn)血肌酐和蛋白尿等水平增加，所以對實驗動物選擇性要求更高。同時ddY小鼠成本更高，且ddY小鼠病理類型和臨床表現(xiàn)程度不成正比，故在國內(nèi)選擇率較低。

近年對于IgAN的研究逐漸深入，有經(jīng)泌尿道感染Mpe，SP-4介質(zhì)，或者磷酸鹽緩沖鹽水來誘導(dǎo)IgAN小鼠模型，其與其他方式誘導(dǎo)動物模型無明顯區(qū)別。也有從動物模型中發(fā)現(xiàn)因為IgAN細(xì)胞和先天免疫的失調(diào)，導(dǎo)致粘膜骨髓軸的免疫失調(diào)，在IgAN中發(fā)揮重要作用。有研究顯示IgAN的發(fā)生與骨髓細(xì)胞有關(guān)，佐楠等等將ddY小鼠的骨髓干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射的方法移植與正常鼠，移植后第6周開始有蛋白尿，系膜基質(zhì)擴張和系膜區(qū)有IgA沉積。還有發(fā)現(xiàn)由動物粘膜上皮分泌的可以位于子宮、支氣管、前列腺的子宮球蛋白(Uteroglobin ,UG)可以通過磷脂A2的調(diào)節(jié)簡潔進行內(nèi)源性的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。根據(jù)這一理論Zheng等建立了UG基因破壞和UG反義RNA被抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠，這兩種小鼠都存在蛋白尿和腎臟IgA、C3的沉積，成為研究IgAN的新的工具。

目前，IgAN發(fā)病通常認(rèn)為與遺傳、免疫及環(huán)境因素有重要關(guān)系。IgAN的治療原則為控制感染、降低血壓、延緩腎功能進展，通常有飲食治療、魚油治療、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI) 或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)，激素治療和免疫抑制劑、手術(shù)切除扁桃體、抗凝等對癥治療和中醫(yī)藥治療等治療方式。

IgAN患者要注重生活習(xí)慣的改善，少食辛辣食物，注意休息，當(dāng)機體疲勞時會出現(xiàn)抵抗力下降引起呼吸道或者腸道感染。感染通常會增加血尿復(fù)發(fā)幾率，故減少感染對減少血尿復(fù)發(fā)有重要意義。對于反復(fù)呼吸道感染引起反復(fù)血尿的患者可手術(shù)切除腭扁桃體控制感染，減少復(fù)發(fā)。

ACEI和ARB類藥物不僅可以降低血壓，而且通過減少蛋白尿延緩腎功能惡化。KDIGO指南推薦使用ACEI和(或)ARB類藥物治療IgAN，并建議當(dāng)尿蛋白大于1.0 g/d時使用ACEI或ARB，根據(jù)血壓調(diào)整藥物用量，對蛋白尿在0.5～1 g/d的患者，指南推薦使用ACEI/ARB類。有專家指出根據(jù)患者的不同情況辨證使用ACEI或者ARB、CCB等種類降壓藥，并建議根據(jù)不用病情進行合理聯(lián)用，以達到治療最佳療效，保護腎功能。

目前免疫抑制治療是治療IgAN的主要手段，免疫抑制分為激素和免疫抑制劑的治療。KDIGO指南建議3～6個月基礎(chǔ)治療后蛋白尿仍>1g/d且腎小球濾過率大于50ml/(min·1.73m2)的患者或者臨床表現(xiàn)為腎病綜合征病理檢查為微小病變或者伴有新月體腎炎或者腎功能快速惡化的患者。有研究發(fā)現(xiàn)激素治療能夠有效控制并減少蛋白尿，保護腎功能，但使用激素仍然存在一些不良反應(yīng)，如出血風(fēng)險增加、血糖升高、高血壓、體重增加、庫欣綜合征等。當(dāng)腎臟病理改變嚴(yán)重或者蛋白尿、血尿明顯增加、腎功能持續(xù)惡化可以使用免疫抑制劑治療或者激素聯(lián)合免疫抑制劑治療，常用的免疫抑制劑有環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A、霉酚酸酯、他克莫司、來氟米特、咪唑立賓等，但免疫抑制劑對肝腎功能的損傷、骨髓抑制、性腺毒性等不良反應(yīng)使免疫抑制劑的使用存在爭議。有學(xué)者指出，免疫抑制劑和激素類藥物聯(lián)用會增加不良反應(yīng)的風(fēng)險。所以要合理利用免疫抑制治療，規(guī)范用法用量，規(guī)律撤減，保護腎功能，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，追求最大遠(yuǎn)期收益。

中醫(yī)藥治療IgAN蛋白尿、血尿取得明顯優(yōu)勢，中醫(yī)認(rèn)為IgAN病機為本虛標(biāo)實，與機體肺、肝脾、腎虛損及感受風(fēng)邪、濕熱、淤血有關(guān)，治療重視扶正祛邪。如史偉教授注重在發(fā)病不同時期予不同治則治法，急性期重視“從咽論治”予銀翹散或甘草桔梗湯疏風(fēng)清熱、清咽解毒減輕呼吸道炎癥；慢性持續(xù)期則重視“從脾補腎”，補后天之本以培先天之本。吉勤等根據(jù)多年臨床經(jīng)驗將IgAN分為風(fēng)熱犯肺、肺腎氣虛等六種證型，分別用銀翹散疏風(fēng)宣肺散寒、六味地黃丸合六君子湯補脾益腎。李四平也注重“從咽論治”，臨床利用清熱解毒、疏風(fēng)祛邪之法治療IgAN取得了較好臨床效果。有醫(yī)家在補脾益腎的基礎(chǔ)上增加清熱解毒利咽之品，如金銀花、玄參、牛蒡子、黃芩、連翹、赤芍、白茅根等減少或去除咽喉感染等因素，降低IgA腎病的復(fù)發(fā)率，延緩病程發(fā)展。潘靜等以實驗證明二半湯能夠有效降低IgAN的蛋白尿。有學(xué)者用大黃為主的中藥湯劑保留灌腸能夠有效降低尿素氮、肌酐等指標(biāo)。還有運用參芪地黃湯聯(lián)合四物湯治療IgA腎病，通過益氣養(yǎng)陰、活血化瘀，兩者結(jié)合能夠有效降低蛋白尿，增加腎小球濾過率，延緩腎功能惡化。中醫(yī)藥治療IgA不僅能夠治療蛋白尿、血尿等臨床癥狀，更能夠減輕激素和免疫抑制劑帶來的不良反應(yīng)，改善癥狀，提高生活質(zhì)量，且中藥聯(lián)合激素使用能夠提高遠(yuǎn)期治療效果。

目前對于IgAN的發(fā)病機制還不能完全明確，建立理想的動物模型對探索IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展機制及疾病診斷、治療具有重要的意義，但目前國內(nèi)外沒有理想的動物模型能夠完全模擬人類疾病發(fā)生發(fā)展的機制，這需要我們一方面探索更理想的動物模型，另一方面利用分子生物學(xué)和生理化學(xué)等相關(guān)學(xué)科的長足發(fā)展進一步豐富造模方法指導(dǎo)IgAN的治療。中醫(yī)中藥從辨證論治出發(fā)治療IgAN，降低蛋白尿、血尿，保護腎功能，但作用機制未完全明確，在實際臨床治療中限制了中醫(yī)藥的發(fā)展，動物實驗的發(fā)展能夠為中醫(yī)藥治療機制的研究提供了條件，目前日趨成熟的動物誘導(dǎo)方法也為實驗提供了基礎(chǔ)。

中醫(yī)藥治療通過辨證論治，從整體出發(fā)對IgAN的治療是多系統(tǒng)、多靶點的，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)和蛋白組學(xué)的理論分析中藥和組方中有效成分，優(yōu)化方劑的組成。利用動物實驗促進中醫(yī)藥有效組分的研究和中醫(yī)藥的長足發(fā)展，不僅要研究中藥單獨治療的療效機制，同時更要促進中西醫(yī)結(jié)合協(xié)同治療IgAN,為中西醫(yī)協(xié)同治療提供基礎(chǔ)。