七氟烷后處理對(duì)失血性休克巴馬小型豬肝功能和BHMT、IL-6、TNF-α的影響

楊竹君,孫永進(jìn),刁玉剛,張鐵錚,孫瑩杰*

0 引言

失血性休克后，肝臟是較易受傷的器官之一，一方面，由于肝的有效循環(huán)血容量減少，導(dǎo)致肝組織的灌注不足，引起肝細(xì)胞的代謝功能異常。另一方面，肝臟的解剖學(xué)和組織學(xué)特征也易導(dǎo)致肝臟受到傷害[1]。七氟烷因其諸多優(yōu)點(diǎn)目前廣泛應(yīng)用于臨床，既往研究結(jié)果表明，七氟醚可減輕失血性休克豬腦損傷[2]和腸黏膜屏障損傷[3]，但是目前關(guān)于七氟烷對(duì)失血性休克后肝臟損傷的保護(hù)作用尚未定論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察七氟烷后處理對(duì)失血性休克巴馬小型豬血清中BHMT、ALT、TNF-α、IL-6、血乳酸濃度及對(duì)肝臟病理組織學(xué)變化的影響，旨在探討七氟烷后處理對(duì)失血性休克肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為減輕失血性休克后器官損傷和并發(fā)癥的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年巴馬小型豬24頭，雌雄不限，體重(23±2)kg，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組8頭。對(duì)照組(S組)，麻醉后股動(dòng)脈置管，頸內(nèi)靜脈置管后,觀察6 h；失血性休克組(HS組)，麻醉置管后建立失血性休克模型，觀察4 h；七氟烷組(Sev組)，麻醉置管后，待巴馬小型豬清醒后建立失血性休克模型，建模成功后吸入2%七氟烷30 min，觀察4 h。本研究動(dòng)物由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 巴馬小型豬失血性休克(HS)模型的建立 巴馬小型豬，術(shù)前禁食12 h，不禁水；皮膚清潔處理，術(shù)區(qū)備皮；術(shù)前取耳緣靜脈穿刺。每頭豬靜脈給丙泊酚3.0 mg/kg，待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬呼吸減慢，肢體活動(dòng)逐漸消失，角膜反射遲鈍至逐漸消失，迅速進(jìn)行氣管內(nèi)插管。麻醉成功后,將巴馬小型豬固定在手術(shù)臺(tái)上，用七氟醚維持麻醉，接通麻醉機(jī)和呼吸監(jiān)測(cè)儀；調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，術(shù)中吸入2%七氟醚維持麻醉，手術(shù)部位備皮，碘伏消毒。左側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺順行留置7F中心靜脈導(dǎo)管三腔,連接測(cè)壓裝置和輸液器;左側(cè)股動(dòng)脈切開(kāi)置管用于采血、放血及血?dú)夥治?，以監(jiān)測(cè)血紅蛋白(Hb)、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)和血乳酸等。操作結(jié)束后，停止吸七氟醚。用麻醉氣體監(jiān)測(cè)設(shè)備監(jiān)測(cè)MAC，待MAC值監(jiān)測(cè)為0時(shí)，進(jìn)行模型制備。采用文獻(xiàn)[4]方法建立豬容量控制性HS模型，待動(dòng)物清醒后自左股動(dòng)脈于15 min 內(nèi)將約40%的血容量(全身血容量按30 mL/kg計(jì)算)勻速放出，制備HS模型,穩(wěn)定60 min認(rèn)為模型制備成功。

1.3 樣本采集及檢測(cè) 各組分別在造模前(T0)、失血性休克后0.5 h(T1)、失血性休克后1 h(T2)、失血性休克1.5 h(T3)、失血性休克2 h(T4)、失血性休克3 h(T5)和失血性休克4 h(T6)等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液標(biāo)本，3 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃保存，備用。待失血性休克模型制備成功4 h后，將豬處死，取肝右葉部分組織，用福爾馬林液固定，剩余肝組織放入-80 ℃冰箱保存。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中BNMT的變化，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α含量變化，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的ALT，應(yīng)用血?dú)夥治鰴C(jī)檢測(cè)外周動(dòng)脈血中的乳酸含量。 將肝組織放入福爾馬林液(中性)中固定，24～48 h后將肝組織取出，用流水沖洗4～5次，將肝組織用濾紙浸干后，經(jīng)梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，浸蠟3 h，包埋蠟塊，切片機(jī)切片，厚約5 μm，37 ℃烤箱過(guò)夜；脫蠟，行HE染色，采用中性樹(shù)膠封片，光鏡(×400，Olympus公司，Et本)下觀察肝組織病理學(xué)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的體重、身長(zhǎng)、體表面積和放血量等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組巴馬小型豬實(shí)驗(yàn)前一般情況(n=8)

2.2 各組肝臟病理組織學(xué)變化 S組肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常，肝小葉中央未見(jiàn)充血。肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)均勻染色，細(xì)胞核染色適度，無(wú)核濃縮。HS組小葉中央肝臟可見(jiàn)空泡樣變形且聚集成簇，多數(shù)肝細(xì)胞的細(xì)胞核濃縮且深染，呈現(xiàn)壞死樣改變。門(mén)管區(qū)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Sev組肝細(xì)胞輕度水腫，門(mén)管區(qū)浸潤(rùn)炎性細(xì)胞較HS組少，見(jiàn)圖1。

2.3 肝臟功能的變化 血清BHMT和ALT含量的變化:與T0時(shí)比較，HS組、Sev組血清BHMT濃度在T1～T2時(shí)點(diǎn)，ALT濃度在T1～T3時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著變化(P>0.05)；血清BHMT濃度在T3～T6時(shí)點(diǎn)，ALT濃度在T4～T6時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，且一直呈持續(xù)上升趨勢(shì)，見(jiàn)表2。組間比較，與S組相比，HS組、Sev組血清BHMT濃度在T3～T6時(shí)點(diǎn)明顯升高，血清ALT濃度在T4～T6時(shí)點(diǎn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sev組血清BHMT濃度在T3～T6時(shí)點(diǎn)明顯降低，血清ALT濃度在T4～T6時(shí)點(diǎn)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 血清TNF-α和IL-6含量的變化 與T0時(shí)比較，HS組、Sev組血清TNF-α濃度在T1時(shí)點(diǎn)，IL-6濃度在T1、T2時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著變化(P>0.05)；血清TNF-α濃度在T2～T6時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，且在休克后2 h達(dá)到峰值，然后呈下降趨勢(shì)；血清IL-6濃度在T3～T6時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，且一直呈持續(xù)上升趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

組間比較，與S組相比，HS組、Sev組血清中TNF-α濃度在T0、T1時(shí)點(diǎn)，血清IL-6濃度在T0～T2時(shí)點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血清TNF-α濃度在T2～T6時(shí)點(diǎn)，血清IL-6濃度在T3～T6時(shí)點(diǎn)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sev組血清TNF-α濃度在T2～T6時(shí)點(diǎn)，血清IL-6濃度在T3～T6時(shí)點(diǎn)明顯低于HS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.5 血清乳酸含量的變化 與T0時(shí)比較，HS組和Sev組血清Lac濃度在T1時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著變化(P>0.05)；在T2～T6時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，且一直呈持續(xù)上升趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組肝臟病理組織學(xué)變化(HE染色,400×)

時(shí)間S組BHMTALTHS組BHMTALTSev組BHMTALTT0295±3030±5309±4033±5295±3028±3T1301±3034±5317±3935±5302±3030±6T2298±2937±7300±4536±4315±3135±7T3302±3042±6409±47*△45±6356±39*△#51±8T4305±3238±5491±46*△101±5*△412±43*△#73±12*△#T5292±2735±6519±45*△146±5*△434±42*△#94±11*△#T6304±3142±5589±51*△171±4*△517±47*△#134±13*△#

注：與T0時(shí)比較，*P<0.05；與S組比較，△P<0.05；與HS組比較，#P<0.05

表3 各組巴馬小型豬各時(shí)點(diǎn)血清TNF-α濃度和IL-6濃度的比較(n=8)

注：與T0時(shí)比較，*P<0.05；與S組比較，△P<0.05；與HS組比較，#P<0.05

結(jié)果顯示，與S組相比，HS組和Sev組在T0～T1時(shí)點(diǎn)血清Lac濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而T2～T6時(shí)點(diǎn)兩組血清Lac濃度均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sev組在T2～T6時(shí)點(diǎn)血清Lac濃度明顯低于HS組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組巴馬小型豬各時(shí)點(diǎn)血清Lac濃度的比較(n=8)

注：與T0比較，*P<0.05；與S組比較，△P<0.05；與HS組比較，#P<0.05；

3 討論

參照國(guó)內(nèi)外成功經(jīng)驗(yàn)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，巴馬小型豬的生理特征與人更加接近；結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，容量控制性HS模型無(wú)論是血流動(dòng)力學(xué)上的變化還是生化指標(biāo)的改變都更接近于失血性休克的病理狀態(tài)[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用巴馬小型豬，失血性休克模型采用容量控制性HS模型。

失血性休克時(shí)，由于機(jī)體的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致腸道的血運(yùn)急劇減少，腸黏膜屏障受損，引發(fā)腸道菌群移位，細(xì)菌和內(nèi)毒素入血，于是肝臟的損傷首當(dāng)其沖[6]。另外，來(lái)自腸道的內(nèi)毒素作用于肝臟的Kupffer細(xì)胞，該細(xì)胞較其他部位的巨噬細(xì)胞更容易活化，產(chǎn)生炎性因子，釋放氧自由基，損傷臨近的肝細(xì)胞[7]。但是肝臟具有強(qiáng)大的代償功能和再生功能，以及傳統(tǒng)的肝功能檢測(cè)不能及時(shí)、敏感地反映肝臟損傷，因此肝臟的損傷在臨床上并未引起應(yīng)有的重視[8]。

臨床上最常用的反映肝細(xì)胞受損、膜通透性改變生化指標(biāo)主要是ALT和AST。ALT有2種同工酶，s-ALT和m-ALT，前者(約11%)存在于線粒體上，后者存在于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)。ALT肝細(xì)胞內(nèi)的濃度為血清內(nèi)濃度的1 000～3 000倍，因此，該指標(biāo)反映肝臟損傷有很好的靈敏性，故成為目前臨床上診斷肝臟損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。而AST、ALP、GGT等反映肝臟損傷，無(wú)論是敏感性方面還是特異性方面均不理想。因此，目前對(duì)反映肝臟損傷的敏感性及特異性生化檢測(cè)指標(biāo)臨床上仍有著實(shí)際的需求[10]。而傳統(tǒng)的肝功能檢測(cè)指標(biāo)AST、ALT、LDH均未達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)。BHMT存在于細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在肝臟組織和腎臟組織中均有表達(dá)。BHMT前期的研究文獻(xiàn)表明，該蛋白是臨床上反映肝臟損傷的一個(gè)理想指標(biāo)[11]。

七氟烷溶解度低，刺激性小，麻醉誘導(dǎo)平穩(wěn)，麻醉維持中機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，在體內(nèi)清除代謝迅速[12-13]，故廣泛應(yīng)用于臨床。隨著臨床缺血再灌注的病例增多和臨床上對(duì)七氟烷的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)七氟烷對(duì)缺血再灌注的器官具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與七氟烷抑制炎癥介質(zhì)釋放相關(guān)[14-15]。Catania等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，七氟烷可以使缺血再灌注肝臟損傷大鼠的血清中AST、ALT濃度顯著降低。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，兩組于休克后2 h，血清中ALT的含量出現(xiàn)顯著降低，血清中的BHMT濃度于失血性休克1.5 h后出現(xiàn)顯著的升高，并呈持續(xù)升高狀態(tài)。

失血性休克引起巴馬小型豬肝臟損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，受多種不同因素的影響。既往研究表明，過(guò)度的炎癥反應(yīng)是引起肝臟損傷的重要因素之一。失血性休克時(shí)，源于腸道的細(xì)菌、內(nèi)毒素和炎癥因子作用于肝臟的枯否氏細(xì)胞，后者被激活，儲(chǔ)存并釋放更多的炎癥因子，其中最主要的炎癥因子包括TNF-α和IL-6等[17]，這些炎癥因子對(duì)失血性休克肝臟損傷起到關(guān)鍵性的作用，可直接引起肝竇細(xì)胞膜的損傷和肝功能的異常。且TNF-α又可刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基和損傷性酶類(lèi)，進(jìn)一步加重肝臟的損傷。本研究結(jié)果顯示，與HS組對(duì)比，Sev組休克后1.0 h，血清中TNF-α的含量均出現(xiàn)顯著降低；兩組血清中IL-6含量于1.5 h均出現(xiàn)顯著降低。該結(jié)果提示，吸入一定濃度的七氟烷有利于減少炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥因子的釋放，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。

失血性休克時(shí),應(yīng)激反應(yīng)亦是引起肝臟損傷的另一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素[18]，源于應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，機(jī)體血糖增高，同時(shí)伴有低血容量和組織乏氧，故血糖代謝大部分處于無(wú)氧酵解途徑，乳酸則是糖無(wú)氧酵解的產(chǎn)物，血乳酸含量可以間接地反映末梢循環(huán)的狀態(tài),組織的缺氧程度以及糖代謝狀況。既往研究表明，異氟醚可較好地降低失血性休克小白鼠模型中血糖和血乳酸的濃度[19]，一定程度地抑制失血性休克引起的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)失血性休克肝臟損傷起到保護(hù)作用。而目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)七氟烷對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下肝臟能量代謝影響的研究尚不確切。本研究結(jié)果顯示，Sev組于休克后1.0～4.0 h，血清中Lac的含量均顯著低于HS組，提示吸入一定濃度的七氟烷有利于緩解組織氧供的相對(duì)不足，減少血乳酸的含量。與此同時(shí)，與HS組對(duì)比，Sev組于休克后4 h肝臟病理組織學(xué)損傷較輕。上述結(jié)果提示，七氟烷可通過(guò)抑制應(yīng)激反應(yīng)，降低Lac濃度，改善肝臟的能量代謝，從而對(duì)失血性休克肝臟損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述,七氟烷對(duì)失血性休克巴馬小型豬肝臟損傷的保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，從而減輕失血性休克對(duì)肝臟的損傷，其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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