ε-聚賴氨酸生產(chǎn)菌的硫酸二乙酯誘變及其 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

李聰，扶教龍*，施磊，吳晨奇，扶明明，胡翠英

(1.蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；3.贛州農(nóng)業(yè)學(xué)校，江西 贛州 341100)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)最早由日本學(xué)者Shima S和Sakai H發(fā)現(xiàn)并命名，他們在試圖尋找一種分泌生物堿的微生物時，意外地從白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了這種生物堿的類似物[1]。

ε-聚賴氨酸是一種賴氨酸的同聚物，與一般氨基酸聚合物不同，它是由α-氨基和ε-羧基的作用將L-賴氨酸殘基連接起來的聚合物，其聚合度一般為25～35[2]。其具有非常廣泛的抑菌譜和優(yōu)異的抑菌效果，對革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌、霉菌和真菌等微生物的生長均有出色的抑制效果[3]。同時，又因?yàn)槠渚哂袩岱€(wěn)定性好、易溶于水、酸堿耐受性強(qiáng)及難以被人體吸收(安全性好)等特點(diǎn)，所以ε-PL被廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域，作為一種綠色健康的食品防腐劑。繼日、美、韓等國家后，我國也于2014年將其批準(zhǔn)用作食品添加劑[4]，ε-PL應(yīng)用的發(fā)展方興未艾。

工業(yè)的生產(chǎn)得益于產(chǎn)量的提高，野生的ε-PL生產(chǎn)菌產(chǎn)量低下，因此對其進(jìn)行育種改造至關(guān)重要。物理、化學(xué)誘變是最傳統(tǒng)同時也是最為行之有效的育種途徑；余明潔、楊玉紅等[5，6]對出發(fā)菌進(jìn)行了紫外誘變，ε-PL產(chǎn)量都有顯著提高；賈士儒、陳瑋瑋等[7，8]用化學(xué)誘變的方法處理了白色鏈霉菌的孢子并取得了不錯的效果。除了培育出更高產(chǎn)的菌種，對其培養(yǎng)基的優(yōu)化能改善生產(chǎn)菌的生長情況與代謝途徑，從而進(jìn)一步提高ε-PL的產(chǎn)量。Shih和Shen[9]對培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)組分(酵母粉、葡萄糖和硫酸銨)進(jìn)行了優(yōu)化，最終產(chǎn)量與原始配方相比提高了98.4%。其中江南大學(xué)利用誘變菌株Streptomycessp. M-Z18經(jīng)補(bǔ)料發(fā)酵，并在發(fā)酵液中加入滑石粉結(jié)合pH沖擊技術(shù)，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到了62.36 g/L，是現(xiàn)階段報道的最高水平[10]。

本實(shí)驗(yàn)對出發(fā)菌白色鏈霉菌FQ-23進(jìn)行Gly，SG，L-Lys三重抗性篩選，通過DES誘變后，篩選得到高產(chǎn)突變菌。然后篩選出更為適合的有機(jī)氮源并利用響應(yīng)面法對原始培養(yǎng)基中的成分進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了更高的ε-PL產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)FQ-23。

1.1.2 儀器設(shè)備

KU-T3紫外-可見光分光光度計 上海精密儀表有限公司；SW-CJ-1FD/2FD型超凈工作臺 蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；DKY-Ⅱ型恒溫調(diào)速回旋式搖床 上海社科自動化有限公司；HT-250B電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海赫田科學(xué)儀器有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 斜面/平板培養(yǎng)基

葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨2 g/L，pH 7.0～7.5，1×105Pa滅菌15 min。

1.1.3.2 三重抗性平板

在斜面/平板培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加Gly 5.95 g/L，SG 4.80 g/L，L-Lys 1.35 g/L，pH 7.0～7.5，1×105Pa滅菌15 min。

1.1.3.3 種子/搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g/L，酵母粉5 g/L，(NH4)2SO410 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，pH 6.8，1×105Pa滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 誘變方法

1.2.1.1 單孢子懸液的制備

將滅菌后的生理鹽水注入斜面，用無菌竹簽將孢子輕輕刮下，充分?jǐn)嚢柚瞥涉咦討乙?，最后?jīng)8層無菌紗布過濾，制成單孢子懸液。

1.2.1.2 誘變時間的選擇

取1 mL單孢子懸液稀釋10倍，用pH為7.0的磷酸緩沖液稀釋7次(每次稀釋10倍)，將最低濃度的孢子懸液分別吸取5 mL至7個小搖瓶中，后將5 mL濃度為2%的DES分別加入小搖瓶中，即DES的含量僅為1%，將7個小三角瓶于恒溫振蕩器中振蕩0～60 min，每隔10 min取出1瓶，在取出的搖瓶內(nèi)加入1 mL硫代硫酸鈉作為誘變終止劑，充分振蕩后保證混勻，孢子濃度稀釋至108左右后將其涂布于平板之上，設(shè)3組平行，30 ℃恒溫培養(yǎng)一段時間，分析誘變時間對死亡率的影響。

1.2.1.3 初篩

將經(jīng)過誘變后的菌株置于平板上，并在30 ℃恒溫的環(huán)境下培養(yǎng)，挑取長勢良好的單菌落，擴(kuò)培至斜面培養(yǎng)基用于下面的復(fù)篩工作。

1.2.1.4 復(fù)篩

從初篩菌株的斜面中各挑取2環(huán)孢子分別接入發(fā)酵搖瓶中，經(jīng)過3天發(fā)酵，測出ε-PL產(chǎn)量。

1.2.1.5 傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將復(fù)篩中得到的高產(chǎn)菌株于斜面進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，并對各代菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定ε-PL產(chǎn)量，考察高產(chǎn)菌株是否具備穩(wěn)定的高產(chǎn)量。

1.2.2 測量方式

1.2.2.1 測定的含量

出于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡目紤]，本文選擇文獻(xiàn)[11]法測定ε-PL的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線參考吳晨奇等[12]的方法。

1.2.2.2 菌體干重(DWC)的測定

取9 mL發(fā)酵液至離心管中，4000 r/min離心10 min，保留沉淀；將該沉淀用去離子水洗滌2次后置于烘箱烘干至恒重。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

通過對酵母粉、玉米漿、牛肉膏、魚粉、生物素和蛋白胨這6種有機(jī)氮源的篩選，挑選出2種最佳的有機(jī)氮源，并對培養(yǎng)基中葡萄糖、硫酸銨和2種有機(jī)氮源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，找出這4種關(guān)鍵成分的最適濃度。各實(shí)驗(yàn)因子濃度梯度設(shè)計見表1。

1.2.3.2 CCD中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計

中心組合實(shí)驗(yàn)(central composite design，CCD)是以2水平全因子和分部實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，發(fā)展出來的1種實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法。它通過對2水平的實(shí)驗(yàn)添加1個設(shè)計點(diǎn)，評估出輸出變量和各因素間的關(guān)系，并將這種非線性關(guān)系擬合生成響應(yīng)面。

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以上述培養(yǎng)基最優(yōu)濃度為基礎(chǔ)，利用對不同因素進(jìn)行分析，并按表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計。

表2 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 2 Design of central composite design g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 DES誘變時間的確定

DES是一種常見的烷化劑，它通過參與和若干堿基的反應(yīng)過程，致使DNA的復(fù)制過程紊亂，其堿基對間的配對出現(xiàn)錯誤，最終導(dǎo)致菌株死亡或變異。因此，其能夠強(qiáng)烈地促成微生物細(xì)胞的變異。在低濃度DES溶液(1%)的作用下，做出致死率與誘變時間之間的關(guān)系圖，通過致死率曲線來找出致死率在80%～85%左右的最佳誘變時間，其致死率曲線見圖1。

圖1 白色鏈霉菌DES誘變致死率曲線Fig.1 The DES fatality rate curve of Streptomyces albulus

由圖1可知，在誘變30 min時，該菌株的致死率約為82%，因此設(shè)置30 min為實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)時間。

2.2 突變菌株抗性篩選

孢子懸液經(jīng)過30 min的誘變后，被涂布于抗性平板之上。設(shè)置3組抗性平板，第1組和第2組分別為加入了較低和較高濃度的Gly，L-Lys和SG的平板；第3組不添加抗性。

挑取平板中長勢最好的單菌落，轉(zhuǎn)接入斜面保藏。本實(shí)驗(yàn)共挑取了40株長勢良好的單菌落，其中1～10號菌挑選自第1組平板，11～20號菌挑選自第2組平板，21～40號菌挑選自第3組平板。將這40株菌分別進(jìn)行72 h左右的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定各自的ε-PL產(chǎn)量。誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，出發(fā)菌產(chǎn)量見圖中虛線所示，為0.896 g/L。

圖2 DES誘變篩選結(jié)果Fig.2 Results of DES mutagenesis screening

由圖2可知，在總共40株菌中，產(chǎn)量高于出發(fā)菌株的有10株，其正突變率為25%，其中1～10號菌株(低濃度3種抗性組別)中有8株產(chǎn)量高于出發(fā)菌株，正突變率高達(dá)80%。其中，3，4，6，7，16，25號這6株菌的ε-PL產(chǎn)量較出發(fā)菌有明顯的提高，3號菌株的產(chǎn)量為1.042 g/L，4號菌株的產(chǎn)量為1.167 g/L，6號菌株的產(chǎn)量為1.219 g/L，7號菌株的產(chǎn)量為1.104 g/L，16號菌株的產(chǎn)量為1.062 g/L，25號菌株的產(chǎn)量為1.090 g/L。

2.3 突變菌株傳代穩(wěn)定性考察

對上述產(chǎn)量較高的6株菌進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)了6代之后發(fā)現(xiàn)3號菌株可穩(wěn)定遺傳，并將其命名為白色鏈霉菌FQF-3。

圖3 菌株FQF-3的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The experimental results of genetic stability of strain FQF-3

由圖3可知，白色鏈霉菌FQF-3的產(chǎn)量較為穩(wěn)定，2～6代菌的產(chǎn)量均高于出發(fā)菌，可用于今后進(jìn)一步的研究。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 不同有機(jī)氮源對ε-聚賴氨酸的影響

有機(jī)氮源對微生物生長至關(guān)重要，只有合理地在培養(yǎng)基中加入有機(jī)氮源，菌體的生長和產(chǎn)物的代謝才能正常進(jìn)行[13]。本部分實(shí)驗(yàn)旨在探究不同有機(jī)氮源對菌體生長和ε-PL合成的影響，見圖4。

圖4 不同有機(jī)氮源對ε-PL產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different organic nitrogen sources on ε-PL production

當(dāng)有機(jī)氮源為魚粉時，ε-PL產(chǎn)量最高，為1.11±0.03 g/L，顯著高于酵母粉等其余有機(jī)氮源。此外，當(dāng)把玉米漿作為培養(yǎng)基中唯一的有機(jī)氮源時，白色鏈霉菌的菌體濃度顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。鑒于發(fā)酵生產(chǎn)時，ε-PL產(chǎn)量與菌體量相偶聯(lián)，越高的菌體量通常代表著越高的產(chǎn)量。因此，我們將魚粉和玉米漿復(fù)配進(jìn)行后續(xù)研究，以期獲得更高的ε-PL產(chǎn)量。

2.4.2 通過實(shí)驗(yàn)確定碳氮源濃度

無可否認(rèn)，氮源是微生物繁殖過程中不可或缺的成分，在上述實(shí)驗(yàn)中選擇了魚粉和玉米漿作為混合有機(jī)氮源后，本部分實(shí)驗(yàn)將混合有機(jī)氮源、葡萄糖和硫酸銨進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以探究不同濃度的相應(yīng)組分對產(chǎn)量的影響，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of single-factor experiment

由表3可知，葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、魚粉的最適濃度分別為50,10,8,12 g/L，ε-PL的產(chǎn)量分別為0.97±0.03，0.95±0.05，0.85±0.03，0.98±0.04 g/L。

2.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.4.3.1 建立模型，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

探討不同因素對菌株培養(yǎng)效果的影響后，利用Design-Expert，設(shè)計成四因素五水平的實(shí)驗(yàn)，以求對上述4大成分進(jìn)一步優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)方案及其結(jié)果見表4。

表4 CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The experimental results of central composite design g/L

將表4中各參數(shù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，通過軟件進(jìn)行擬合從而建立以下方程，表達(dá)不同因素對ε-PL產(chǎn)量(Y)的影響，A，B，C，D分別代表葡萄糖、硫酸銨、玉米漿和魚粉：Y=1.370-0.066A-0.004B-0.010C+0.027D-0.006AB+0.005AC-0.004AD+0.010BC+0.009BD-0.007CD-0.083A2-0.087B2-0.081C2-0.110D2。

對結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸系數(shù)檢驗(yàn)表Table 5 ANOVE analysis for regression equation

續(xù) 表

由表5可知，該模型總體的P值(P-Value)<0.0001，表明總體來說，該模型偶然誤差很小，有較好的擬合度且高度顯著；其中，失擬項(xiàng)(Lack of Fit)僅為0.1131，可見該模型的失擬項(xiàng)較小，失擬并不顯著，模型較為可靠；經(jīng)過計算可知，方程系數(shù)接近1，擬合度較好，由此可見，我國能夠直接通過這一方程直觀地表現(xiàn)出ε-PL產(chǎn)量與4個自變量之間的關(guān)系，從而預(yù)測出較為準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.4.3.2 優(yōu)化響應(yīng)面

為探討不同因素之間的影響以及與菌株產(chǎn)量之間的關(guān)系，本文設(shè)計了單因素實(shí)驗(yàn)，并且得到了不同的響應(yīng)面圖，見圖5～圖10。

圖5 葡萄糖和(NH4)2SO4的響應(yīng)面結(jié)果Fig.5 Response surface plot for glucose and (NH4)2SO4

圖6 玉米漿和葡萄糖的響應(yīng)面結(jié)果Fig.6 Response surface plot for corn pulp and glucose

圖7 葡萄糖和魚粉的響應(yīng)面結(jié)果Fig.7 Response surface plot for glucose and fish meal

圖8 (NH4)2SO4和玉米漿的響應(yīng)面結(jié)果

圖9 (NH4)2SO4和魚粉的響應(yīng)面結(jié)果Fig.9 Response surface plot for (NH4)2SO4 and fish meal

圖10 玉米漿和魚粉的響應(yīng)面結(jié)果Fig.10 Response surface plot for corn pulp and fish meal

由圖5～圖10可知，各因素過高或過低均會影響ε-PL的發(fā)酵水平，當(dāng)保持其中一成分不變時，ε-PL的產(chǎn)量會先隨著另一成分的增加而增加，但當(dāng)該成分超過一定值時，ε-PL的產(chǎn)量則會相應(yīng)降低，反之亦然。以圖5為例子，如果葡萄糖的濃度始終保持不變，那么當(dāng)硫酸銨的濃度不斷提高時，可發(fā)現(xiàn)菌株的產(chǎn)量也有所提高。換言之，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，直到硫酸銨濃度超過10 g/L，ε-PL的產(chǎn)量開始隨硫酸銨濃度的提高而下降。當(dāng)保持硫酸銨濃度不變時，ε-PL產(chǎn)量與葡萄糖濃度的關(guān)系大致相同，也是先提高后降低。

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，通過軟件對各參數(shù)的分析，得到了預(yù)估的最佳成分，見表6。

表6 培養(yǎng)基預(yù)測結(jié)果表Table 6 The prediction results of medium composition g/L

表6中所示成分加上M3G培養(yǎng)基中剩余成分即為最佳培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基下，預(yù)估所得ε-PL產(chǎn)量達(dá)到了1.373 g/L，比出發(fā)菌株提高了53.2%。

2.4.3.3 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證

按上述的配方往培養(yǎng)基中加入各物料，隨后等待菌株發(fā)酵，在此過程中將搖瓶放入搖床并設(shè)置搖床條件為：30 ℃，200 r/min，經(jīng)過72 h的培養(yǎng)，測出發(fā)酵液中ε-PL的含量。進(jìn)行3次同樣的實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分別為1.368,1.374,1.371 g/L。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值基本保持一致。換言之，本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有研究意義，所建立的模型準(zhǔn)確性較高。

3 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)以在StreptomycesalbulusFQ-23的基礎(chǔ)上，利用DES誘變的方式，得到了1株穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)菌株FQF-3，經(jīng)6代連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)量穩(wěn)定在0.976 g/L，與出發(fā)菌株相比提高了8.93%；經(jīng)過篩選，將魚粉與玉米漿作為發(fā)酵產(chǎn)ε-PL的混合有機(jī)氮源；通過單因素結(jié)合響應(yīng)面的方法對其培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，可知培養(yǎng)基最合適的組合是(g/L):葡萄糖49.70，(NH4)2SO49.95，玉米漿7.79，魚粉12.52，磷酸二氫鉀1.36，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.8，硫酸亞鐵0.03，硫酸鋅0.04，此時，ε-PL的預(yù)測產(chǎn)量為1.373 g/L，是出發(fā)菌株產(chǎn)量的1.53倍；經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，得到ε-PL產(chǎn)量的平均值為1.371 g/L，與預(yù)測值非常接近，表明此模型具有可行性。

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