外源糞菌干預對受體豬腸道屏障功能的影響研究

耿世杰，李 媛，程賽賽，胡欒莎，岳曉敬，韓新燕

（浙江大學動物科學學院,農(nóng)業(yè)部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，浙江杭州 310058）

在動物腸道健康領域，腸道內(nèi)的微生物群落由于能發(fā)揮各種重要功能，已引起越來越多研究者的廣泛關注。大量研究表明，腸道菌群不僅參與腸道內(nèi)多項代謝進程，還在機體腸屏障功能的構(gòu)建和黏膜免疫系統(tǒng)的成熟方面發(fā)揮重要作用[1]。外源糞菌干預是一種直接將健康外源供體的糞便菌群移植到受體胃腸道內(nèi)進而重塑消化道菌群結(jié)構(gòu)，促進腸道健康的微生態(tài)調(diào)節(jié)途徑[2]。在醫(yī)學上，通過糞菌移植（Fecal Microbiota Transplantation，F(xiàn)MT）的方式進行外源糞菌干預可以有效治療一些難治性胃腸疾病，例如艱難梭菌感染和炎癥性腸病[3]，而且已有研究表明外源糞菌還能發(fā)揮調(diào)節(jié)受體黏膜免疫應答和腸道生理功能的作用[4]。在動物生產(chǎn)上，有關糞菌移植能否通過提升腸屏障功能促進動物腸道健康的研究鮮有報道。

哺乳仔豬的消化道結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育完善、腸黏膜屏障尚不健全，其作為糞菌移植受體有利于觀察與分析外源糞菌干預對腸道功能的調(diào)節(jié)作用。金華豬是我國著名的地方豬種，除肉質(zhì)好、繁殖率高外，在面對應激時還具有更強的抗逆性和維持腸道功能穩(wěn)態(tài)的能力[5]。本研究選用健康成年金華豬作為糞菌移植供體，通過對杜×長×大三元雜交哺乳仔豬進行糞菌移植，探究外源糞菌干預對受體豬腸道屏障功能的影響，進而為糞菌移植技術在動物生產(chǎn)領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選取未使用藥物或藥物性飼料添加劑3個月以上、無消化紊亂癥狀的80 kg左右健康金華豬作為糞菌移植供體，采集新鮮糞樣并參考Pang等[6]方法制備糞菌懸液。Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自Invitrogen公司。熒光定量試劑盒購自Applied Biosystems公司。組織總蛋白提取試劑盒及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）一抗購自Santa Cruz Biotechnology，二抗購自Thermo Pierce公司。二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid，BCA）法蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物公司。分泌型免疫球蛋白A陽性（SIgA+）細胞免疫組織化學分析一抗購自Bethyl Laboratories，二抗購自DAKO公司。

1.2 試驗動物與設計 試驗選用初生重相近、胎次相同、同日出生的杜×長×大三元雜交哺乳仔豬12窩，隨機分為2組，每組6個重復（窩），每個重復（窩）10～12頭仔豬。試驗組1～10日齡隔天灌喂1 mL金華豬糞菌懸液進行外源糞菌干預；對照組灌喂等量無菌0.1 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2，含10%甘油）。試驗期至仔豬27日齡（斷奶前1 d），從10日齡開始對所有仔豬補充相同教槽料進行誘食，試驗期間仔豬自由哺乳進食和飲水。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 樣品采集 分別于12日齡和27日齡每組隨機選取6頭仔豬，肌肉注射4%戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg BW）進行麻醉，待麻醉完全后屠宰取樣。屠宰前將仔豬置于保溫箱內(nèi)過夜禁食12 h，宰前稱重。腸道黏膜樣品的收集與保存：截取回腸和結(jié)腸中部約10 cm，縱向剖開，在生理鹽水中將內(nèi)容物洗凈；用玻璃棒快速刮取腸道黏膜樣品，保存于-80℃冰箱中待測。腸道鏡檢樣品的收集與保存：縱向剖開十二指腸、空腸和回腸，于相同位置分別取長度約1 cm的腸段，在生理鹽水中輕輕漂洗去除腸壁附著內(nèi)容物，隨后使腸腔面朝上平鋪在濾紙上將液體吸干，浸入10%甲醛固定液并置于4℃冰箱中保存用于制作石蠟切片。

1.3.2 生長性能和腹瀉率測定 在12日齡和27日齡時，試驗仔豬絕食12 h，自由飲水，以重復為單位對試驗仔豬進行空腹稱重，計算試驗期間平均日增重（ADG）。

仔豬腹瀉率=腹瀉仔豬數(shù)×腹瀉時間/（仔豬總數(shù)×27）×100%

1.3.3 腸道光鏡切片的制作與顯微測量 固定液中組織塊修整為適當大小，流水沖洗24 h。沖洗好的組織置于Leica TP1020脫水機脫水、透明與浸蠟，使用Leica EG1160組織包埋儀包埋。使用Leica RM2135旋轉(zhuǎn)切片機將組織塊切為厚度6 μm的切片，隨后將切片置于Leica HI1210烤片機上烤片。將烤好的載玻片置于Leica Autostain BRXL染色機中進行蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色，隨后使用二甲苯透明，樹膠加蓋玻片封片。使用Leica專用萬能顯微鏡數(shù)碼拍照，光鏡下使用Leica Qwin軟件進行定量分析，每個樣品觀察6個非連續(xù)性4 μm縱切片，每張縱切片測定10個絨毛高度和隱窩深度。

1.3.4 腸黏膜杯狀細胞數(shù)測定 ①石蠟切片脫蠟至水。②0.5%高碘酸水溶液氧化10～15 min。③流水沖洗數(shù)分鐘，蒸餾水換洗2次。④雪夫試劑暗處浸染30～40 min。⑤流水沖洗10 min。⑥蘇木素復染核30 ～60 s，1%鹽酸水溶液分化3 s，氨水返藍。⑦無水乙醇脫水（兩缸各5 min）。⑧正丁醇處理30 s。⑨二甲苯透明（兩缸各5 min），中性樹膠封片。⑩糖原高碘酸-雪夫（Periodic Acid-schiff，PAS）染色后在光鏡下觀察，紅色糖原染色細胞即為杯狀細胞，高倍鏡下隨機選擇6個視野統(tǒng)計杯狀細胞數(shù)量進行比較。

1.3.5 黏蛋白基因Muc2mRNA相對表達量測定 根據(jù)GenBank已報道的豬Muc2和GAPDH基因序列，使用Primer Premier 6.0軟件設計相應特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

取出-80℃保存的回腸和結(jié)腸樣品50～100 mg，按照Trizol試劑盒說明書（Invitrogen，貨號：12183-555）提取總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度，結(jié)果顯示OD值均在1.8～2.0。反轉(zhuǎn)錄按照SuperScript? III First-Strand Synthesis SuperMix for qRTPCR試劑盒說明書進行操作（反應體積為20 μL）。按照Power SYBR?Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒說明書加入相應反應試劑（Applied Biosystems，貨號：4367659），反應體積為20 μL，組成為8.0 μL SDW，10 μL Power SYBR? Green Master Mix，0.5 μL 上 游引物（10 μmol/L），0.5 μL 下游引物（10 μmol/L），1 μL cDNA。擴增條件均為95℃預變性30 s，95℃變性 5 s，60℃ 退火 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)之后檢測熒光信號。每個樣品做3個重復，每個樣品目標基因mRNA相對表達量=2-△△Ct。

表1 PCR反應的引物序列

1.3.6 黏蛋白Muc2和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin相對表達量測定 使用T-PER Tissue Protein Extraction Reagent總蛋白提取試劑盒（Thermo Pierce，貨號：78510）進行組織總蛋白提取，使用BCA定量試劑盒（碧云天，貨號：P0010）進行總蛋白定量。配置分離膠和濃縮膠對樣品總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）分析。聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Difluoride，PVDF）膜在甲醇中浸泡后轉(zhuǎn)移至三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸（Tris-Glycine）轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡，SDS-PAGE凝膠在Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液平衡，隨后以恒壓全濕轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后放入吐溫-三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水緩沖液（Tween-tris Buffered Saline， T-TBS）室溫封閉，使用T-TBS漂洗。將一抗（表2）以一定比例溶于T-TBS，4℃孵育過夜，使用T-TBS漂洗。

表2 一抗信息

二抗溶于T-TBS室溫放置1 h，使用T-TBS漂洗5次。二抗為Goat anti-Mouse IgG（H+L）Secondary Antibody（Thermo Pierce，貨號：31160），Goat anti-Rabbit IgG（H+L）Secondary Antibody（Thermo Pierce，貨號：31210），稀釋度為 1:5000。使用 SuperSignal?West Dura Extended Duration Substrate，按說明書操作，制備約1 mL增強化學發(fā)光（Enhanced Chemiluminescence，ECL）工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，然后去除多余ECL試劑，保鮮膜密封，暗盒中放上X-ray film曝光5～10 min后進行顯影和定影。采用Image J軟件分析條帶的光密度值，每個條帶重復3次。

目的蛋白相對表達量=（目的蛋白光密度值/內(nèi)參光密度值）×10n

1.3.7 分泌型免疫球蛋白A陽性（SIgA+）細胞數(shù)測定 ①石蠟切片脫蠟至水。②切片置于乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）抗原修復緩沖液（PH=9.0）中進行抗原修復，冷卻后置于PBS（PH=7.4）中晃動洗滌。③放入3%過氧化氫溶液避光孵育，隨后置于PBS（PH=7.4）中晃動洗滌。④滴加3%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）或者10%正常兔血清覆蓋組織，室溫封閉30 min。⑤甩掉封閉液，切片滴加一抗（山羊抗豬SIgA抗體），4℃孵育。⑥置于PBS（PH=7.4）中晃動洗滌，稍甩干后滴加二抗（山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體），室溫孵育50 min。⑦置于PBS（PH=7.4）中晃動洗滌，稍甩干后滴加二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，沖洗切片終止顯色。⑧Harris蘇木素復染3 min左右，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水返藍。⑨將切片脫水透明，中性樹膠封片。⑩顯微鏡鏡檢，圖像采集并分析。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Excel完成整理，使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05為差異顯著。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 外源糞菌干預對受體豬生長性能的影響 由表3可知，試驗組1～27日齡仔豬的ADG與成活率顯著高于對照組（P＜0.05），腹瀉率顯著低于對照組（P＜0.05）。

表3 外源糞菌干預對受體豬生長性能的影響

2.2 外源糞菌干預對受體豬腸道形態(tài)的影響 由表4可知，試驗組12日齡回腸絨毛高度/隱窩深度顯著高于對照組（P＜0.05），其他腸道形態(tài)指標與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。27日齡時，試驗組十二指腸、空腸和回腸隱窩深度均顯著低于對照組（P＜0.05），空腸和回腸絨毛高度/隱窩深度顯著高于對照組（P＜0.05），其他腸道形態(tài)指標與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 外源糞菌干預對受體豬腸道屏障功能的影響

2.3.1 外源糞菌干預對腸道杯狀細胞數(shù)和黏蛋白Muc2表達的影響 由圖1可知，與對照組相比，試驗組回腸和結(jié)腸杯狀細胞分布面積增加，且含有大量黏蛋白分泌顆粒。由表5可知，試驗組12日齡和27日齡回腸與結(jié)腸杯狀細胞數(shù)均顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖1 腸道杯狀細胞PAS染色圖（40×）

外源糞菌干預對腸道黏蛋白基因Muc2的mRNA相對表達量及黏蛋白表達的影響結(jié)果見圖2、表6和表7。與對照組相比，試驗組12日齡回腸和結(jié)腸Muc2mRNA相對表達量和黏蛋白表達水平均顯著提高（P＜0.05）；27日齡時，試驗組結(jié)腸Muc2mRNA相對表達量和黏蛋白表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），回腸Muc2mRNA相對表達量和黏蛋白表達水平與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 腸道黏蛋白Muc2代表性Western blot蛋白條帶

2.3.2 外源糞菌干預對腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表達的影響 外源糞菌干預對12日齡腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表達的影響結(jié)果如圖3和表8所示。與對照組相比，試驗組12日齡回腸和結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白表達水平顯著提高（P＜0.05）。

表4 外源糞菌干預對受體豬腸道形態(tài)的影響

表5 外源糞菌干預對腸道杯狀細胞數(shù)量的影響

表6 外源糞菌干預對腸道黏蛋白基因Muc2 mRNA相對表達量的影響

圖3 腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin代表性Western blot蛋白條帶

圖4 腸道SIgA+細胞免疫組織化學分析（200×）

2.3.3 外源糞菌干預對腸道SIgA+細胞數(shù)的影響 腸道SIgA+細胞免疫組織化學分析結(jié)果如圖4所示，對照組和試驗組回腸、結(jié)腸均出現(xiàn)陽性染色。進一步進行光密度分析的結(jié)果（表9）表明，試驗組12日齡結(jié)腸SIgA+細胞光密度值顯著高于對照組（P＜0.05），而回腸SIgA+細胞光密度值與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；27日齡時，試驗組回腸與結(jié)腸SIgA+細胞光密度值與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 外源糞菌干預對受體豬生長性能及腸道形態(tài)的影響多項研究表明腸道微生物與動物機體的體重、生長具有顯著相關性，如Ramayo-Caldas等[7]對豬腸道微生物相互作用網(wǎng)絡進行分析，首次發(fā)現(xiàn)腸道菌群與豬生長性狀密切相關；Han等[8]通過16S rDNA高通量測序也發(fā)現(xiàn)，高體重豬的腸道菌群多樣性顯著高于低體重豬，同時高體重豬具有更高水平的厚壁菌門以及厚壁菌門∶擬桿菌門，該研究通過對2種豬的腸道菌群進行PICRUSt功能預測分析進一步發(fā)現(xiàn)，高體重豬的腸道菌群具有與物質(zhì)降解相關通路更高水平的富集。本試驗表明，外源糞菌干預在一定程度上提高了受體豬的生長性能。筆者認為，外源糞菌干預對受體豬生長性能的影響可能由2個方面決定：一方面，外源糞菌干預能提高移植受體腸道菌群的多樣性，促進菌群將機體自身無法利用的多種營養(yǎng)物質(zhì)（例如未消化的多糖和蛋白質(zhì)等）作為底物進行發(fā)酵，并最終生成可被腸道和菌群直接吸收利用的物質(zhì)，進而提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與利用效率[9]；另一方面，外源糞菌干預促進了受體豬腸道結(jié)構(gòu)的發(fā)育并增強了消化吸收功能。O'loughlin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，由于腸道絨毛萎縮和隱窩肥大而導致對營養(yǎng)物質(zhì)、水分和電解質(zhì)消化與吸收作用減弱是誘發(fā)腹瀉的重要因素。而幼齡哺乳動物腹瀉會嚴重影響機體正常的生長發(fā)育，進而導致生長性能降低和死亡率升高。本研究結(jié)果表明，外源糞菌干預能顯著促進受體豬腸道形態(tài)發(fā)育，提高其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收效率，進而減少腹瀉的產(chǎn)生。

表7 外源糞菌干預對腸道黏蛋白Muc2蛋白表達的影響

表8 外源糞菌干預對腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表達的影響

表9 外源糞菌干預對腸道SIgA+細胞數(shù)量的影響

3.2 外源糞菌干預對受體豬腸道屏障功能的影響 黏蛋白、緊密連接蛋白和分泌型免疫球蛋白A（SIgA）是機體腸道屏障功能的3個重要組成部分。Muc2是腸道黏液層中最主要的黏蛋白，由杯狀細胞分泌，能高效抑制有毒有害物質(zhì)對腸上皮細胞的損傷并參與腸道化學屏障功能的構(gòu)建。腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin是腸道上皮屏障的重要組成成分，其能有效阻止腸腔內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)及細菌等物質(zhì)的旁細胞轉(zhuǎn)運，維持腸道上皮屏障的完整性。SIgA+細胞是由腸道固有層內(nèi)的B細胞經(jīng)增殖、分化形成的成熟漿細胞，其合成和分泌的SIgA是機體腸道免疫屏障中的主要抗體，能使腸道免受病原體和毒素的危害。

本試驗發(fā)現(xiàn)，對受體仔豬進行外源糞菌干預可增加腸道杯狀細胞和SIgA+細胞數(shù)，提高黏蛋白和緊密連接蛋白表達，進而實現(xiàn)對受體仔豬腸道屏障功能的調(diào)節(jié)。大量研究表明，腸道菌群經(jīng)自身合成和分解所生成的代謝產(chǎn)物不僅能作為營養(yǎng)物質(zhì)被腸道上皮細胞吸收和利用，還能作為調(diào)節(jié)機體腸屏障功能的信號分子發(fā)揮生理調(diào)控作用。例如，無法被動物機體自身消化酶所降解的植物性多糖能夠在結(jié)腸厭氧共生菌丁酸弧菌屬和梭菌屬等細菌的發(fā)酵作用下生成短鏈脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸。Gaudier等[11]研究表明，丁酸除了作為結(jié)腸上皮細胞的主要能源物質(zhì)之外，還能促進杯狀細胞分化和黏蛋白表達進而增強腸道黏膜免疫能力。除此之外，腸道雙歧桿菌生成的乙酸能阻止腸出血性大腸桿菌誘導的腸上皮細胞凋亡和炎癥反應進而維持上皮細胞完整性和保護腸道免受感染[12]。腸道菌群代謝色氨酸生成的吲哚及其衍生物同樣能在腸屏障功能的維持方面發(fā)揮重要作用。Escherichia coli是吲哚的經(jīng)典合成菌，且吲哚能作為一種“群體感應信號”調(diào)節(jié)E.coli和其他細菌的毒性和生物膜形成過程，并且對腸道具有有益作用[13]。有研究表明，腸道共生菌生成的吲哚能通過促進結(jié)腸上皮細胞緊密連接和黏附連接表達增強腸道上皮屏障功能[14]。Wlodarska等[15]在最近的一項研究中也發(fā)現(xiàn)，機體腸道內(nèi)消化鏈球菌屬的代謝產(chǎn)物吲哚丙烯酸能對腸上皮屏障功能發(fā)揮有益作用并幫助緩解腸道炎癥反應。除外源性物質(zhì)之外，腸道菌群對內(nèi)源性物質(zhì)膽汁酸的代謝同樣能影響腸屏障功能。在進入腸道之后，膽汁酸除了發(fā)揮幫助機體吸收和運輸飲食中脂肪的作用之外，還能激活腸道內(nèi)的特異性受體例如法尼酯X受體（Farnesoid X Receptor，F(xiàn)XR）或G蛋白偶聯(lián)受體（G Proteincoupled Receptor，GPCR）及其下游相關信號通路進而影響腸道免疫功能[16-17]。由于具有膽汁酸鹽水解酶（Bile Salt Hydrolase，BSH）和脫羥基酶活性的特定細菌群落能夠影響機體內(nèi)的膽汁酸組成，并且膽汁酸受體結(jié)合不同種類膽汁酸的親和度也各不相同，當腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，菌群能通過影響機體內(nèi)膽汁酸的組成進而對膽汁酸受體相關信號通路進行調(diào)節(jié)并影響腸道屏障功能和免疫應答[18]。外源糞菌干預可能通過改變腸道菌群物質(zhì)代謝途徑，促進腸道屏障功能相關代謝產(chǎn)物的合成及下游信號通路的激活[2]，進而調(diào)節(jié)受體豬腸道屏障功能，然而其具體機制仍有待進一步研究。

4 小 結(jié)

外源糞菌干預能通過增加腸道杯狀細胞和SIgA+細胞數(shù)、提高黏蛋白和緊密連接蛋白表達的方式調(diào)節(jié)受體豬腸道屏障功能，具有維持豬腸道功能穩(wěn)態(tài)和促進腸道健康的作用。

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