高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定六味補(bǔ)血膠囊中沒食子酸、芍藥苷和藁本內(nèi)酯含量

關(guān)瀟瀅 ，曾利娜 ，胡曉諭 ，溫曉麗 ，趙 渝 ，肖麗和

(1.廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057； 2.深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518057； 3.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016)

六味補(bǔ)血膠囊以經(jīng)典補(bǔ)血養(yǎng)血方劑四物湯為基礎(chǔ)，在當(dāng)歸、白芍、熟地黃及川芎4味藥材基礎(chǔ)上輔以黃芪和紫草，具有益氣補(bǔ)血之功效，對(duì)女性氣血兩虛之癥具有確切療效[1]。六味補(bǔ)血膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)YBZ05452009）中含量測(cè)定項(xiàng)僅選取方中佐藥白芍所含的芍藥苷進(jìn)行測(cè)定，并未對(duì)君藥當(dāng)歸及其他藥味進(jìn)行含量控制，存在不足。為完善該制劑的含量測(cè)定方法，本研究中選取當(dāng)歸中主要成分藁本內(nèi)酯[2-4]、白芍中沒食子酸[5]和芍藥苷[6-7]作為測(cè)定指標(biāo)，并參照藁本內(nèi)酯[8-9]、沒食子酸[10-12]、芍藥苷[13-15]3種成分的含量測(cè)定方法，建立同時(shí)測(cè)定上述3種成分含量的高效液相色譜(HPLC)法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

E2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司)，包括2998 PDA檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度泵、Empoer3色譜工作站；XS205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TW423L型分析天平（日本島津公司）；SB-25-12DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

六味補(bǔ)血膠囊（深圳國(guó)源國(guó)藥有限公司，批號(hào)分別為 20151204，20151205，20151206）；沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)為 110831-201605，純度為 90.8%），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為 110736-201741，純度為 95.7% ），藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111737-201507），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；甲醇，磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry Shield RP18ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，梯度洗脫條件見表 1；柱溫：35℃；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：沒食子酸 280 nm，芍藥苷230 nm，藁本內(nèi)酯334 nm，采用波長(zhǎng)切換方式檢測(cè)；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2 溶液制備

取沒食子酸對(duì)照品80.22 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對(duì)照品貯備液；取芍藥苷對(duì)照品 101.48 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，定容至刻度，搖勻，作為芍藥苷對(duì)照品貯備液；取藁本內(nèi)酯對(duì)照品10.49 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，定容至刻度，搖勻，作為藁本內(nèi)酯對(duì)照品貯備液。均置4℃冰箱備用。精密量取沒食子酸對(duì)照品貯備液0.5 mL、芍藥苷對(duì)照品貯備液 0.5 mL、藁本內(nèi)酯對(duì)照品貯備液 0.2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

稱取六味補(bǔ)血膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶，加甲醇約20 mL，超聲處理30 min，放置室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照六味補(bǔ)血膠囊的處方及制法，制備不含當(dāng)歸和白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果沒食子酸、芍藥苷和藁本內(nèi)酯峰與其他吸收峰均達(dá)到基線分離，陰性無干擾(見圖1)。

線性關(guān)系考察：精密量取沒食子酸對(duì)照品貯備液和芍 藥 苷 對(duì) 照 品 貯 備 液 0.125，0.250，0.500，1.250，2.000，2.500 mL，藁本內(nèi)酯對(duì)照品貯備液 0.04，0.10，0.20，0.30，0.40，1.00 mL，置 10 mL 容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按擬訂色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定峰面積。結(jié)果見表2?？梢?，儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取六味補(bǔ)血膠囊（批號(hào)為20151206）內(nèi)容物適量，依法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見表2。可見，方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，4，8，12，16，24 h 時(shí)測(cè)定。結(jié)果見表 2?？梢?，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖

表2 線性關(guān)系考察、精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的六味補(bǔ)血膠囊（批號(hào)為 20151206）內(nèi)容物 6份，精密稱定，各約 0.5 g，分別加入沒食子酸對(duì)照品貯備液1.0 mL、芍藥苷對(duì)照品貯備液3.0 mL、藁本內(nèi)酯對(duì)照品貯備液0.5 mL。依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量及回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取六味補(bǔ)血膠囊(批號(hào)分別為20151204，20151205，20151206)內(nèi)容物1 g，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

表4 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

曾考察以相同體積的50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇進(jìn)行超聲提取，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，比較沒食子酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯的含量。結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑時(shí)，沒食子酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯的含量最高，穩(wěn)定性最好，峰形對(duì)稱，分離度好，故選用甲醇作為提取溶劑。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別取沒食子酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯對(duì)照品貯備液，于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，沒食子酸約在280 nm波長(zhǎng)處，芍藥苷約在230 nm波長(zhǎng)處，藁本內(nèi)酯約在334 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。綜合樣品中3個(gè)成分的出峰時(shí)間，設(shè)定為 280 nm（0→20 min）、230 nm（20 → 30 min）、334 nm（30 → 44 min），并采用波長(zhǎng)切換的方式，實(shí)現(xiàn)各個(gè)成分在最大吸收波長(zhǎng)處同時(shí)檢測(cè)。

3.3 流動(dòng)相選擇

曾以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相，考察分離效果。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，樣品中的各個(gè)成分分離效果最好。

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