-環(huán)糊精修飾毛細管區(qū)帶電泳測定三黃片中大黃有效成分含量

曾 雪 ，陳 竹 ，劉應杰 ，楊元娟 ，夏培元

（1.重慶醫(yī)藥高等專科學校，重慶 401331；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；3.重慶市化學藥品質量控制與評價協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 401121；4.中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院，重慶 400050；5.重慶市藥物制劑工程技術研究中心，重慶 401331）

三黃片是2015年版《中國藥典（一部）》收載的中成藥，主要由大黃、鹽酸小檗堿和黃芩浸膏組方，具有清熱解毒、瀉火通便功效[1-3]，主治三焦熱盛、目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、心煩口渴、尿黃便秘。2015年版《中國藥典(一部)》采用高效液相色譜（HPLC）法測定三黃片中大黃有效成分的含量[4]，但液相色譜存在操作過程復雜，流動相處理要求高，試劑消耗量大等問題[5-9]。高效毛細管電泳（HPCE）法是一種由經(jīng)典電泳技術發(fā)展起來的分離分析技術，具有高靈敏度、高分辨率和低成本等優(yōu)點，緩沖溶液處理簡單，操作簡便。該方法是液相色譜法的有力補充，但國內相關研究非常少[10-11]。本研究中采用β-環(huán)糊精修飾毛細管區(qū)帶電泳同時檢測三黃片中大黃活性成分大黃素和大黃酚的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent CE7100型高效毛細管電泳儀（美國安捷倫公司）；SPD-15C型紫外檢測器（日本島津公司）；GWA-UN1型超純水器（北京普析通用儀器有限公司）；SK-1型渦旋混合器(常州市國旺儀器制造有限公司)；AUX220電子天平(日本島津公司)。

1.2 試藥

三黃片(廣西金諾制藥有限公司，批號為120612201603)；Na2B4O7·10H2O（分析純，重慶北碚精細化工工廠，批號為 SJY160724）；無水碳酸鈉（分析純，重慶北碚精細化工工廠，批號為 SJG160724）；羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD，相對分子質量 1 459.8，ACROS ORGANICS，New Jersey，USA，批號為 QG11031）；大黃素(C15H10O5，批號為 20160711)，大黃酚(C15H10O4，純度≥98.0%，批號為20160848)，均購于美侖生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 電泳參數(shù)設置

分離柱：熔融石英毛細管柱（75 μm ×67.4 cm，有效長度51 cm，河北永年瑞豐色譜配件有限公司）；緩沖溶液：60 mmol／L Na2B4O7+40 mmol／L Na2CO3+40 mmol／L HP-β -CD(pH=8.9)，供試品緩沖溶液與此相同；分離電壓：15 ～30 kV；進樣方式：壓差進樣；進樣時間：5 s；操作溫度：25℃；檢測波長：254 nm。

2.2 溶液制備

取大黃素對照品和大黃酚對照品適量，精密稱定，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）的混合溶液，制成每1 mL含大黃素10 μg、大黃酚25 μg的混合對照品溶液。取樣品(批號為120612201603)20片，除去包衣，精密稱定，研細（過 3 號篩），取約 0.26 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒杯中，蒸干，加30%乙醇-鹽酸（10∶1）的混合溶液15 mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強力振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷，蒸干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）的混合溶液溶解，轉移至25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 電泳條件優(yōu)化

毛細管預處理：毛細管柱分別用0.1 mol／L NaOH沖洗活化10 min，水洗5 min，再用緩沖溶液沖洗5 min。每次進樣前都分別用 0.1 mol／L NaOH沖洗 3 min，水洗1 min，再用緩沖溶液沖洗2 min。

進樣方式選擇：毛細管電泳的進樣方式對分離效率和重復性有重要影響。壓力進樣和電動進樣為最常見的2種進樣方式，電動進樣對黏度較大的生化樣品比較適合，但測量重復性較差，且可能因各組分擴散系數(shù)的差異而導致遷移速率的改變，三黃片中大黃有效成分的提取物相對生化樣品黏度較低，且需注重重復性，因此選擇壓力進樣作為進樣方式。進樣壓力0.5 psi，進樣時間0.5 s。

緩沖溶液優(yōu)化：大黃素和大黃酚的化學結構相似，電荷差異小，且大黃提取中成分較多，采用區(qū)帶電泳分離模式（CZE）較難實現(xiàn)3種目標組分的完全分離。因此，本試驗中通過加入在緩沖體系中加入低濃度HP-β-CD，在傳統(tǒng)的CZE電泳模式下引入膠束電色譜模式，增加不同組分在分配系數(shù)上的差異。當HP-β-CD濃度達到40 mmol／L時，實現(xiàn)完全分離，高效毛細管電泳圖見圖1。

圖1 大黃混合對照品的高效毛細管電泳圖

2.4 方法學考察

專屬性試驗：依照2015年版《中國藥典(一部)》中三黃片的制法[4]，除不加入大黃藥材，其余制法步驟與三黃片制法一致，并將制作的樣品按2.2項下方法配制供試品溶液，與三黃片實際樣品在相同條件下進行毛細管電泳分析。結果三黃片中輔料與其他成分對大黃有效成分無干擾(見圖2)，方法專屬性良好。

圖2 三黃片輔料和三黃片高效毛細管電泳圖

檢出限與定量限試驗：分別取2.2項下對照品溶液，按擬訂電泳條件測定檢出限和定量限。結果大黃素和大黃酚的檢出限分別為 0.78 μg／mL 和 0.51 μg／mL，定量限分別為 2.0 μg ／mL 和 2.5 μg ／mL。

重復性試驗：精密量取2.2項下對照品溶液適量，按擬訂電泳條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果大黃素和大黃酚的 RSD分別為1.76%和1.53%(n=6)，表明儀器精密度良好。

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下大黃素和大黃酚對照品溶液，以加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）的混合溶液為稀釋液，配置成質量濃度分別為 1，5，10，15，20μg／mL的大黃素對照品溶液和質量濃度分別為2.5 μg／mL，12.5 μg ／mL，312.5 μg ／mL，1.56 g ／L，7.8 g ／L 的大黃酚對照品溶液。并分別以擬訂電泳條件進行電泳分析檢測，以質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行回歸分析，得回歸方程，大黃素 Y=0.078 11X-0.038 1(r=0.995 1)，大黃 酚 Y=0.082 11 X-0.042 1(r=0.995 7)。結果表明，大黃素和大黃酚的質量濃度線性范圍分別為2.0～18.5μg／mL，2.50～1.56×103μg／mL。

加樣回收試驗：取樣品(批號為120612201603)粉末約0.26 g，精密稱定，共3份，分別置 5個錐形瓶中，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂電泳條件檢測并記錄每份樣品的電泳譜圖，再在每份供試品中加入等量的大黃素和大黃酚對照品各0.3 mg，再次測定其含量，分別計算大黃素和大黃酚的平均回收率。結果見表1。結果顯示該方法單組分回收率較好，多組分 RSD偏高，分析可能是由于大黃提取物成分較多，且本方法是同時考察兩組分在電泳中的含量，目標組分間存在化學性質差異，導致檢測效率不一致。

2.5 樣品含量測定

分別取不同批次三黃片樣品粉末約0.26 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂電泳法測定含量。結果見表2。

表1 加樣回收試驗結果(n=3)

表2 3批樣品中大黃素和大黃酚含量測定結果（n=3）

3 討論

三黃片中大黃有效成分主要為大黃素和大黃酚，兩種組分化學結構相似，帶電差異小，傳統(tǒng)區(qū)帶電泳（CZE）模式分離效果較差。本試驗中采用HP-β-CD修飾毛細管區(qū)帶電泳的方式分離檢測，由于環(huán)糊精分子具有略呈錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結構，具有一定的疏水性，在傳統(tǒng)緩沖體系中增加了一定的多相特性，待分離組分在具有環(huán)糊精的緩沖體系中，由于不同的疏水性而呈現(xiàn)出不同的分配系數(shù)，導致組分在毛細管電泳中表明，不僅受電滲流的影響，同時也受到分配色譜的影響，有利于組分的完全分離。

方法學考察發(fā)現(xiàn)，含量測定的 RSD偏高，分析原因，該方法是建立在保證三黃片中大黃有效成分的分離度之上的，在實現(xiàn)各指標組分的完全分離情況下，一定程度上影響了含量測定的準確度，導致結果 RSD偏高，后期可在方法優(yōu)化上進一步改進。

本試驗中并未對緩沖溶液pH進行系統(tǒng)優(yōu)化，因為大黃素和大黃酚均為弱酸性，且其帶電荷特性相近，在保證電滲流的情況下，pH對大黃素和大黃酚的分離并非主要影響因素。

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