疏肝清脂法干預(yù)PI3K/Akt信號(hào)通路在動(dòng)脈粥樣硬化中的分子機(jī)制研究

張 歡，于 睿

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 沈陽(yáng) 110847）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，是冠心病、血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。脂質(zhì)代謝異常是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。調(diào)控血脂代謝，也是防治AS的前提[1-3]。脂質(zhì)代謝異常是通過(guò)損害血管壁內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致AS的發(fā)生，改善脂質(zhì)代謝，恢復(fù)血管內(nèi)皮功能，防止炎癥細(xì)胞黏附，抑制血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖和遷移，在AS的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用。人口老齡化社會(huì)進(jìn)程的加速，心腦血管疾病的發(fā)病率亦不斷升高。我國(guó)每年因心腦血管疾病死亡的人數(shù)約有400萬(wàn)，占總病死率41%，在我國(guó)60歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)79.9%。心腦血管疾病不僅給人們的生命健康構(gòu)成重大威脅，也給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以，AS發(fā)生機(jī)制的研究具有重要的社會(huì)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 中醫(yī)對(duì)本病的認(rèn)識(shí)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化屬“胸痹”“眩暈”“癡呆”“中風(fēng)”等范疇，其主要發(fā)生機(jī)制與氣滯、痰濁、血瘀有關(guān)，尤其是肝失疏泄，氣機(jī)郁滯。《血證論·臟腑病機(jī)論》云：“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化；設(shè)肝之清陽(yáng)不升，則不能疏泄水谷，滲泄中滿之證，在所不免”，《血證論》云：“以肝屬木，木氣沖和條達(dá)，不致遏郁，則血脈通暢”， 所以肝失疏泄，氣機(jī)郁滯是引發(fā)本病的常見原因。肝失疏泄也可以導(dǎo)致膽汁分泌排泄功能障礙，從而影響膽固醇的排出，使血脂代謝失常，故治療當(dāng)以疏肝清脂為主。在生理上，心主血脈，肝藏血，主疏泄，二者共同調(diào)節(jié)血液在血脈中運(yùn)行；在經(jīng)絡(luò)循行上，肝同心包絡(luò)同屬厥陰經(jīng)，有經(jīng)絡(luò)相連接，肝失疏泄，氣滯血瘀，血脈瘀阻而致胸痹的發(fā)生。正如《素問·藏氣法時(shí)論篇》云：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛，兩臂內(nèi)痛。”《靈樞·厥病》篇載：“厥心痛，色蒼蒼如死狀，終日不得太息，肝心痛也”?！堆κ厢t(yī)案》云：“凡心臟得病，必先調(diào)其肝”。在臨床上從肝論治胸痹往往可收到較好的效果。

臨床實(shí)踐表明，AS日久常出現(xiàn)胸悶、胸痛、眩暈等氣滯血瘀癥狀，故改善AS當(dāng)以疏肝理氣為主?！峨y經(jīng)》第十難有云：“心脈急甚者，肝邪干心也”。沈金傲的《雜病源流犀燭·心病源流》提出，七情除“喜之氣能散外，余皆足令心氣郁結(jié)而為痛也”，故運(yùn)用疏肝理氣，清脂通脈為主治療，符合中醫(yī)從整體出發(fā)，治人勝于治病及留人治病的理論。也有醫(yī)家認(rèn)為久病及脾腎，重視健脾補(bǔ)腎法，結(jié)合疏肝、豁痰、祛瘀等，但終歸以疏肝清脂為其治療之本。實(shí)驗(yàn)研究表明，自擬方疏肝清脂顆?？筛纳蒲x，防治AS，減輕西藥降脂藥物引起的不良反應(yīng)?；跀?shù)據(jù)挖掘技術(shù)，梳理分析古代和近現(xiàn)代文獻(xiàn)，在各醫(yī)家從脾論治AS基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性提出了“從肝論治”“以絡(luò)論治”動(dòng)脈粥樣硬化消退斑塊的理論。深入研究疏肝清脂法防治動(dòng)脈粥樣硬化消退斑塊的機(jī)制，從基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的CD40/CD40L信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制研究到干預(yù)NPC1L1表達(dá)抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的研究和代謝組學(xué)研究，證實(shí)“疏肝清脂法”能有效防治AS，穩(wěn)定斑塊，消退AS。從中醫(yī)學(xué)整體觀念的角度，我們思考疏肝清脂所發(fā)揮作用的本質(zhì)，借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究策略，采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)研究整體觀大背景之下的生物分子之間的相互作用及其傳遞規(guī)律。

2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)

AS的分子機(jī)制復(fù)雜，主要涉及膽固醇浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)反應(yīng)、內(nèi)皮功能紊亂、免疫失調(diào)、氧化應(yīng)激、血小板活化等。近年發(fā)現(xiàn)，AS與VSMC發(fā)生增殖和遷移密切相關(guān)。VSMC的增殖和遷移過(guò)程中有巨噬細(xì)胞自噬的趨勢(shì)。脂質(zhì)代謝異常能通過(guò)誘發(fā)巨噬細(xì)胞自噬引起VSMC的增殖和遷移，導(dǎo)致AS的發(fā)生[4]。

2.1 VSMC增殖和遷移與AS密切相關(guān) VSMC是維持血管張力和功能的主要細(xì)胞成分，其由分化表型轉(zhuǎn)化為去分化表型，并隨之出現(xiàn)的增殖和遷移是AS等心血管疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[3]。AS的VSMC增殖和遷移過(guò)程涉及巨噬細(xì)胞的自體吞噬、細(xì)胞外基質(zhì)的降解和蛋白分子標(biāo)志物的改變，如巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，肌動(dòng)蛋白抑制蛋白-1（PFN1）、微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（LC3）、脂聯(lián)素（Adp）等表達(dá)上調(diào)，Atgl2和泛素樣蛋白Atg5、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等表達(dá)下調(diào)，其中重要的標(biāo)志性變化是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)減少， VSMC標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP-2和MMP-9）表達(dá)減少；另外，核轉(zhuǎn)錄因子（NF-KB）及基質(zhì)金屬蛋白家族在VSMC轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮重要作用[5-6]。

2.2 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與AS的發(fā)生發(fā)展 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路是影響AS的諸多因素激發(fā)胞內(nèi)信號(hào)的匯聚點(diǎn)。研究[7-8]證明，PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要通過(guò)以下途徑抗AS：1）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、人類生長(zhǎng)因子（HGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、NF-KB、MMP-2和MMP-9等是VSMC內(nèi) PI3K/Akt 信號(hào)最重要細(xì)胞因子。TGF-β可以與相應(yīng)受體結(jié)合，通過(guò)激活 PI3K/Akt 信號(hào)通路，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，調(diào)節(jié) MMP 的含量與活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，在斑塊形成、發(fā)展和破裂過(guò)程中起著重要的作用。2）PI3K/Akt 信號(hào)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)NF-KB等核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，直接抑制VSMC增殖；3）PI3K/Akt 信號(hào)誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9表達(dá)，影響斑塊的形成和進(jìn)展。

PI3K/Ak信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)VSMC增殖、遷移及細(xì)胞凋亡影響AS病變發(fā)生發(fā)展。PI3K是一類特異性磷酸酰肌醇磷脂3位羥基激酶，具有脂類激酶和蛋白激酶的活性[9]。Akt是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性，可在PI3K作用下生成磷酸化Akt（pAkt）而激活，pAkt又進(jìn)一步激活下游因子發(fā)揮作用。研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛參與了AS的形成過(guò)程，包括VSMC增生、病理性新生血管生成、炎癥細(xì)胞聚集等，促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，PDGF在VSMC表型轉(zhuǎn)換中起主要作用，而PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖與PI3K活性減弱相關(guān)。抑制 PI3K /Akt /mTOR 信號(hào)通路能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減少斑塊巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而穩(wěn)定AS易損斑塊[10]。

3 清脂通脈顆粒對(duì)AS兔血脂、炎癥因子及 PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響

有關(guān)中醫(yī)藥與PI3K/Akt信號(hào)通路之間聯(lián)系的研究較少。目前鮮有疏肝清脂法通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路而啟動(dòng)VSMC增殖與遷移來(lái)抗AS的報(bào)道。在前期項(xiàng)目“從肝論治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制及內(nèi)脂素基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究”中，運(yùn)用疏肝解郁、平肝清脂之法，應(yīng)用中藥適度干預(yù)而抑制VSMC增殖，減少AS斑塊內(nèi)的脂質(zhì)，延緩或消退AS，相對(duì)增加斑塊內(nèi)的膠原含量，達(dá)到穩(wěn)定斑塊的的作用。同時(shí)前期進(jìn)行了疏肝清脂顆粒消退動(dòng)脈硬化斑塊的有效性、安全性評(píng)價(jià)研究，重點(diǎn)研究了疏肝清脂藥物藥效學(xué)、穩(wěn)定性、毒性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并在動(dòng)物藥理毒理前期研究基礎(chǔ)上，深入研究疏肝清脂顆粒對(duì)消退、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制。

對(duì)清脂通脈顆?？笰S的前期研究及在此基礎(chǔ)上提出工作設(shè)想：既然PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是VSMC中最為活躍的細(xì)胞途徑之一[11-13]，激活后能啟動(dòng)VSMC增殖與遷移，而啟動(dòng)VSMC增殖是抗AS的機(jī)制之一，那么清脂通脈顆粒是否會(huì)通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制VSMC增殖與遷移而起到抗AS的作用。筆者在動(dòng)物藥理毒理前期研究基礎(chǔ)上，建立新西蘭大耳白兔高脂血癥模型，進(jìn)一步探討疏肝清脂法對(duì)消退、穩(wěn)定AS斑塊的機(jī)制研究。結(jié)果證明：疏肝清脂顆?？擅黠@降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，降低MMP-2，MMP-9活性，降低CD40/CD40L活性，升高TIMP-2活性，消退AS斑塊。研究證實(shí)，疏肝清脂顆粒通過(guò)降低血脂，減少脂代謝異常對(duì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害，恢復(fù)血管內(nèi)皮功能，防止炎性細(xì)胞黏附，抑制VSMC增殖和遷移，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，有效降低血脂后，改善血管內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而穩(wěn)定斑塊，防止其破裂，使AS發(fā)生和發(fā)展受到抑制，豐富和發(fā)展了防治血脂異常和動(dòng)脈粥樣硬化的理法方藥[14-17]。

因此提出假說(shuō)：“清脂通脈顆?？赡芡ㄟ^(guò)干預(yù)PI3K/AKT 信號(hào)通路的活性，抑制VSMC增殖與遷移，延緩AS的形成及進(jìn)展。”研究結(jié)果可能部分揭示“肝主疏泄”的本質(zhì)，同時(shí)為豐富AS的病機(jī)與治法理論提供新的思路與方法。

4 小結(jié)

綜上所述，疏肝清脂顆粒通過(guò)干預(yù)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制VSMC增殖和遷移影響AS的機(jī)制研究具有重要的科學(xué)意義。本項(xiàng)目擬從該通路調(diào)節(jié)機(jī)制切入，探究疏肝清脂顆粒與AS PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)基因、蛋白質(zhì)表達(dá)之間的聯(lián)系，抑制VSMC增殖和遷移發(fā)生AS，明確疏肝清脂顆粒干預(yù)AS中的分子機(jī)制，為尋找中醫(yī)藥改善AS的有效靶點(diǎn)提供分子生物學(xué)依據(jù)。

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