EMS誘變及其在構(gòu)建花生突變體庫(kù)中的應(yīng)用

楊秀麗，楊麗萍，寧東賢，趙玉坤，李 楠

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000）

花生是我國(guó)重要油料作物之一，種植面積近466.7萬(wàn)hm2，占全球的29%，總產(chǎn)居國(guó)內(nèi)五大油料作物之首。在我國(guó)，花生的消費(fèi)主體是榨油，為了滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)花生油的需求、提高花生食品品質(zhì)、延長(zhǎng)貨架壽命，選育優(yōu)質(zhì)專(zhuān)用型花生成為花生育種的主要方向。

在我國(guó)，幾乎每年都有一些新育成的花生品種被推向市場(chǎng)，但絕大多數(shù)推廣品種的親本是“伏花生”和“獅頭企”，或者是含有它們的血緣[1]。優(yōu)勢(shì)新品種的選育決定于作物遺傳基因多樣性的豐富度，過(guò)多使用遺傳背景相同或相似的親本材料，會(huì)導(dǎo)致栽培種花生基因的大量流失，其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄、遺傳變異率低，使得有性雜交重組中無(wú)法創(chuàng)造新的基因變異，優(yōu)異性狀的產(chǎn)生受到限制，無(wú)法獲得在農(nóng)藝性狀和品質(zhì)上突出的花生品種[2]。另外，花生是自花授粉作物，它的四倍體栽培種與其二倍體野生種之間存在的倍性差異以及遠(yuǎn)緣雜交不親和性，阻礙了它們之間的基因交流，使得花生選育工作很難有突破性的進(jìn)展[3]。因此，在花生遺傳育種工程中，需要一種有效方法來(lái)解決這些問(wèn)題，創(chuàng)制出農(nóng)藝性狀優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)、配合力高和遺傳基礎(chǔ)廣泛的優(yōu)異新種質(zhì)。

化學(xué)誘變育種周期短、進(jìn)程快、可以獲得大量的變異性狀，這些特點(diǎn)是常規(guī)育種所不具備的?；瘜W(xué)誘變育種利用誘變劑處理作物的花粉、種子、芽或莖稈等，發(fā)生誘變的后代產(chǎn)生可遺傳的變異，育種家根據(jù)育種目標(biāo)，對(duì)突變體進(jìn)行鑒定和篩選，最終選育出遺傳穩(wěn)定的新品系或新品種[4-5]。在作物育種中，常用的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯（EMS）、疊氮化鈉（NaN3）和平陽(yáng)霉素（PYM）。EMS是一種高效、穩(wěn)定和良好的化學(xué)誘變劑，目前在誘變育種中應(yīng)用最廣泛、效果也最好。

1 EMS誘變?cè)砼c特點(diǎn)

EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）分子式CH3SO2OC2H5，分子量124，無(wú)色液體，水中溶解度為8%，pH值7條件下在水中半衰期20℃時(shí)是93 h，30℃時(shí)26 h。EMS是一種烷化劑，它帶有1個(gè)或多個(gè)活性烷基，這些基團(tuán)能夠轉(zhuǎn)移到一個(gè)電子密度高的分子上，置換堿基中的氫原子。EMS是通過(guò)與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應(yīng)來(lái)誘發(fā)突變的，當(dāng)鳥(niǎo)嘌呤G的N-7位置被烷基化，成為一個(gè)帶正電荷的季銨集團(tuán)，進(jìn)而發(fā)生2種遺傳效應(yīng)：一是烷化的鳥(niǎo)嘌呤（G）與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，代替胞嘧啶（C），發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變；二是由于N7烷基活化，糖苷鍵斷裂造成脫嘌呤，而后在DNA復(fù)制過(guò)程中，烷基化鳥(niǎo)嘌呤（G）與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，導(dǎo)致堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，即原來(lái)的G∶C對(duì)可以變?yōu)槿魏螇A基對(duì) G∶C，C∶G，A∶T，T∶A[6-7]。這種單一堿基對(duì)的改變形成了點(diǎn)突變。

EMS被認(rèn)為是目前化學(xué)誘變效果最好而負(fù)面影響相對(duì)較少的誘變劑，它具備3個(gè)特性：一是高突變頻率和相對(duì)較少的染色體畸變，易于后代突變體的篩選；二是試驗(yàn)材料受到的損傷相對(duì)較輕；三是EMS具有強(qiáng)烈的揮發(fā)性與致癌性[8]。

2 EMS誘變材料與方法

EMS誘變育種存在2個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一是選擇合適的供試材料；二是采用有效的處理方法。供試材料的不同將會(huì)引起誘變效率和后代篩選難度的不同，而有效的處理方法會(huì)在保證誘變劑高效滲入誘變部位的同時(shí)，作物的進(jìn)一步生長(zhǎng)和發(fā)育不會(huì)受到制約，最終產(chǎn)生突變個(gè)體，完成育種過(guò)程。

2.1 誘變材料

研究者通常根據(jù)作物的繁殖方式和染色體倍數(shù)來(lái)選擇誘變的部位，比如種子、花藥、花粉、塊莖和葉片等，一般農(nóng)作物的化學(xué)誘變最常用的供試材料是種子和花粉。誘變材料的處理途徑根據(jù)供試材料的不同有所差別，常用的途徑有浸泡法（種子、芽）、滴液法（莖）、注射法（花器）、涂抹法（花絲、莖）和共培養(yǎng)法（根、花藥）等。EMS誘變花生通常用種子作為供試材料，也有將EMS直接注入花生花器或涂抹果針的方法來(lái)獲得誘變體。SIVARAM等[9-10]用EMS處理花生種子，均選育出高產(chǎn)品系。FANG等[11]通過(guò)EMS誘變處理花生種子，篩選出了1個(gè)油酸含量高達(dá)60%以上的弗吉尼亞型花生突變體e2-4-83-12。殷冬梅等[12]選擇一片子葉但保留完整的花生胚作為種子外植體進(jìn)行EMS誘變，確定了不同品種的適宜誘變組合。王傳堂等[13]將EMS直接注入花生開(kāi)放花朵的龍骨瓣內(nèi)，獲得了超大果和超小果的突變體，種子的蛋白質(zhì)含量和粗脂肪含量有明顯提高。魯花12號(hào)是用EMS處理雜交組合的F1果針誘變育成的[14]。

2.2 誘變方法

構(gòu)建花生突變體庫(kù)中，要獲得良好的誘變效果，操作者除了選擇合適的誘變材料外，更重要的是選用適宜的誘變劑量（誘變劑量＝誘變液濃度×處理時(shí)間），最佳誘變劑量取決于EMS誘變濃度和處理時(shí)間的組合。此外，溫度和pH值對(duì)誘變效應(yīng)也有影響。

花生栽培種具有4種基因型，分別是普通型、珍珠豆型、多粒型和龍生型。育種家已經(jīng)對(duì)前3種類(lèi)型進(jìn)行了一些化學(xué)誘變的研究，結(jié)果表明，不同的基因型對(duì)誘變劑的響應(yīng)是存在差異的，在半致死量的條件下，不同基因型的誘變劑量是不一致的。一般情況下，隨著EMS溶液濃度的提高，誘變率相對(duì)增加，而對(duì)供試材料產(chǎn)生的生物學(xué)損傷也隨之變大，因此，在選擇誘變濃度時(shí)，既要能達(dá)到比較豐富的變異，又不致于對(duì)材料損傷過(guò)大。另外，誘變處理的時(shí)間越長(zhǎng)，EMS在材料中的滲透程度越高，造成的生理?yè)p傷程度也相應(yīng)越強(qiáng)，而適宜的處理時(shí)間使受處理組織完全水合和被誘變劑浸透，因此，對(duì)種子進(jìn)行誘變時(shí)，可預(yù)先浸泡，使種子內(nèi)部的代謝和合成活躍起來(lái)，以縮短處理時(shí)間。

王允等[15]用5個(gè)EMS濃度（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）分別注入2份花生品系的龍骨瓣中，田間觀察發(fā)現(xiàn)，2份品系畸變率隨EMS濃度升高而增大。朱保葛等[10]用1個(gè)濃度（0.3%），3個(gè)處理時(shí)間（5，10，15 h）分別處理不同基因型的花生材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EMS誘導(dǎo)花生產(chǎn)生的突變頻率因基因型和持續(xù)處理時(shí)間的不同而不同，各基因型對(duì)EMS處理的誘變反應(yīng)不一致。殷冬梅等[12]、楊富軍等[16]均設(shè)置多個(gè)誘變組合，以半致死量為選擇條件，發(fā)現(xiàn)不同基因型品種對(duì)EMS的敏感性存在差異，篩選出各基因型品種的適宜誘變組合。

3 后代突變體的篩選鑒定方法

3.1 表型鑒定

誘變后代的突變體篩選是以誘變育種和基因功能研究為目的的，表型鑒定作為最常用的方法，要求必須有能遺傳的、相對(duì)于野生型有顯著差異的外觀性狀，其中也包括逆境篩選和化驗(yàn)分析篩選[17]。表型鑒定是基于作物的表型性狀數(shù)據(jù)做出的分析鑒定。表型性狀數(shù)據(jù)就是作物的形態(tài)特征數(shù)據(jù)，以花生為例，包括數(shù)量性狀（主莖高、側(cè)枝長(zhǎng)、有效枝長(zhǎng)、總分枝數(shù)、單株結(jié)果數(shù)等）和質(zhì)量性狀（葉型、葉色、株型、分枝型、花色、莖枝茸毛等）的數(shù)據(jù)。

表型性狀是基因型、環(huán)境以及基因型與環(huán)境互作效應(yīng)的綜合表現(xiàn)，是可以直接觀測(cè)的[18]。作物的一個(gè)表型可能由單個(gè)基因控制，也可能由多個(gè)基因控制，而作物的多個(gè)表型可能由多個(gè)基因控制，也可能由單個(gè)基因控制，由于表型和基因間的復(fù)雜關(guān)系，大多數(shù)的突變有多個(gè)突變表型。另外，數(shù)量性狀受外部環(huán)境條件影響頗大，在突變體的篩選中，需要通過(guò)多代的田間觀測(cè)鑒定來(lái)避免這一因素的影響[19]。

王傳堂等[13]在田間觀察2個(gè)花生誘變材料的后代，發(fā)現(xiàn)了果多果飽和表現(xiàn)特優(yōu)的品系，從而獲得了單株結(jié)果數(shù)、單株仁質(zhì)量、飽果率比野生型明顯提高的突變體。朱保葛等[10]在花生M2中統(tǒng)計(jì)出13種表型性狀突變類(lèi)型，對(duì)6個(gè)產(chǎn)量性狀連續(xù)3 a進(jìn)行了篩選對(duì)比和分析，得到了花生高產(chǎn)突變品系。

經(jīng)過(guò)誘變的花生通過(guò)田間觀察后代的表型性狀，發(fā)現(xiàn)不同表型的突變體，經(jīng)過(guò)篩選和鑒定，獲得突出的目的性狀，是誘變育種的理想結(jié)果，整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)便、成本低，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易遺漏一些變異性狀。

3.2 分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)方法是從分子水平來(lái)分析和比較DNA的堿基序列，挖掘突變體，確定突變頻率，它可以在早期鑒定植株是否發(fā)生遺傳變異，這種方法也稱(chēng)為DNA分子標(biāo)記。分子標(biāo)記用于鑒定突變體的優(yōu)點(diǎn)在于突變位點(diǎn)以DNA形式表現(xiàn)，在植株的各個(gè)組織、各生育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受外部環(huán)境的干擾。目前，常用的分子標(biāo)記檢測(cè)方法有RELP，RAPD，SSR，AFLP，CAPS和基于單個(gè)核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記等。殷冬梅等[12]使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同的突變體進(jìn)行了檢測(cè)，找到了EMS誘變花生的突變位點(diǎn)，從分子水平上為突變的產(chǎn)生提供了有力的依據(jù)。房超琦[20]在分子水平上研究了高油酸突變體E-2-4-83-12的FAD2B基因編碼區(qū)的堿基對(duì)發(fā)生了突變。

近年來(lái)，定向誘導(dǎo)基因組局部突變（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）技術(shù)提供了從分子水平上定向規(guī)?；Y選突變體的技術(shù)平臺(tái)，它是基于反向遺傳學(xué)策略，將EMS誘變、PCR定向篩選和高通量檢測(cè)方法相結(jié)合，它可以高通量、快速準(zhǔn)確地篩選出由EMS誘變產(chǎn)生的單核苷酸多態(tài)性（SNPS,single nucleotide polymorphisms）和INDELS[21-22]。TILLING 技術(shù)的主要流程是：（1）EMS誘變種子，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列點(diǎn)突變；（2）單株種植M1；（3）產(chǎn)生 M2種子；（4）提取 M2單株的 DNA，存放于96孔微滴定板中，收獲且保存M3種子，形成種子庫(kù)；（5）構(gòu)建DNA池；（6）設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增大量的目標(biāo)分析區(qū)域；（7）變性、退火，獲得野生型和突變型發(fā)生錯(cuò)配的異源雙鏈核酸分子；（8）酶切異源雙鏈核酸分子，產(chǎn)物變性，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；（9）篩選突變子；（10）使用相同的方法在8倍庫(kù)中找到突變單株[23]。目前，TILLING技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、大豆、水稻、大麥、擬南芥等20多種作物[24]，檢測(cè)出大量目標(biāo)基因變異位點(diǎn)，獲得了多個(gè)不同類(lèi)型的突變體，由此建立了相應(yīng)的突變體庫(kù)，為育種提供新的材料和種質(zhì)。

目前EMS誘變花生產(chǎn)生的突變體后代，其篩選主要依靠表型鑒定，但存在EMS誘發(fā)產(chǎn)生的一系列點(diǎn)突變難以鑒定的問(wèn)題，而TILLING技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高頻率點(diǎn)突變與PCR篩選技術(shù)的有效結(jié)合，這樣既可以獲得點(diǎn)突變的等位基因，又可在小范圍突變?nèi)后w內(nèi)篩選到目標(biāo)基因的突變體。雖然在EMS誘變花生的研究中尚沒(méi)提到利用TILLING技術(shù)來(lái)規(guī)?；Y選突變體的報(bào)道，但是隨著花生基因組序列的完成和公布，TILLING技術(shù)將很快被應(yīng)用到其中。

4 應(yīng)用前景

EMS誘變?cè)谧魑镉N中的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，育種家通過(guò)化學(xué)誘變的方法，隨機(jī)改變遺傳信息，利用正向遺傳學(xué)原理，從表型數(shù)據(jù)入手，獲得優(yōu)異突變體，或者依據(jù)反向遺傳學(xué)策略，檢測(cè)出基因突變位點(diǎn)，建立相應(yīng)的突變體庫(kù)。無(wú)論哪種篩選方法，育種家總會(huì)獲得一些優(yōu)異突變體作為下一步選育或雜合的材料，最終選育出優(yōu)異品種。我國(guó)擁有近7 000份的花生種質(zhì)資源，包括栽培種和野生種，種質(zhì)類(lèi)型豐富，具備高油、高蛋白、高油酸以及抗逆、抗病等優(yōu)異性狀的種質(zhì)材料很多，遺傳多樣性相對(duì)豐富[25]，但是，目前市場(chǎng)上大部分主推品種遺傳血緣相近，如果利用化學(xué)誘變來(lái)改變花生種質(zhì)的遺傳信息，建立不同類(lèi)型的突變體庫(kù)，從中選擇優(yōu)異種質(zhì)資源或中間材料，將為花生育種開(kāi)辟一條更加廣闊的天地。