代謝組學(xué)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用＊

繆瀟瑤，肖炳坤，孫云波，王翠芳，楊建云，黃榮清＊＊

（1.軍事科學(xué)軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 510006）

中藥復(fù)方集中體現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥預(yù)防與治療疾病的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)，是中醫(yī)臨床用藥的主要手段。建立符合中藥復(fù)方自身特點(diǎn)的研究方法來(lái)系統(tǒng)的揭示其科學(xué)內(nèi)涵將有助于中藥復(fù)方的現(xiàn)代化發(fā)展和傳承。代謝組學(xué)通過(guò)測(cè)定生物體系在內(nèi)在、外在因素作用下其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化來(lái)研究該生物體代謝網(wǎng)絡(luò)的變化，它最大的特點(diǎn)是建立了整體觀來(lái)剖析生命現(xiàn)象本質(zhì)，這與中醫(yī)整體觀理念十分契合[1,2]。代謝組學(xué)采用現(xiàn)代儀器分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可進(jìn)行系統(tǒng)性、整體性、客觀性的分析，為中藥復(fù)方研究提供了嶄新的研究思路[3]。本文總結(jié)了本課題組近幾年運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)開(kāi)展的中藥復(fù)方相關(guān)研究工作，同時(shí)回顧了其他學(xué)者的研究成果，對(duì)代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用概況及研究成果進(jìn)行總結(jié)與分析，并對(duì)其研究前景進(jìn)行展望。

1 代謝組學(xué)概論

代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[4]。代謝組是某一時(shí)刻生物體所有內(nèi)源性代謝物的集合，反映了其整體狀況。代謝組學(xué)是在特定時(shí)間內(nèi)系統(tǒng)的分析某一生物體或細(xì)胞內(nèi)所有小分子內(nèi)源性化合物（相對(duì)分子量＜1000）的差異性表達(dá)[5]。根據(jù)研究目的可以將代謝組學(xué)分為發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)，發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)（非靶向代謝組學(xué)）主要分析對(duì)照組和模型組代謝譜差異表達(dá)，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法尋找差異性代謝物并進(jìn)行鑒定，解釋代謝物與生物代謝途徑或生理狀態(tài)之間的聯(lián)系[6]。靶向代謝組學(xué)一般通過(guò)分析大量天然和變異生物樣本，對(duì)已確證的差異表達(dá)代謝物進(jìn)行定量驗(yàn)證[7]。目前代謝組學(xué)常用的分析技術(shù)有核磁共振（NMR）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，如 NMR[8]、HPLC-NMR-MS[9]、HPLC-MS[10]、UPLCMS[11]、GC-MS[12]、SFC-MS[13]、CE-MS[14]、ICP-MS[15]、IMMS[16]，此外還有 FT-ICR/MS[17]、FTIR[18]。目前，代謝組學(xué)運(yùn)用以上現(xiàn)代分析技術(shù)在疾病研究[19,20]（生物標(biāo)志物的尋找、治療療效監(jiān)控、診斷）、藥物研發(fā)[21,23]、安全性評(píng)價(jià)[24]、中醫(yī)藥[25,26]、農(nóng)業(yè)[27,28]、營(yíng)養(yǎng)學(xué)[29,30]、環(huán)境毒理學(xué)[31,32]、微生物[33,34]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

2 代謝組學(xué)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用

2.1 中藥復(fù)方的安全性評(píng)價(jià)

中藥及其復(fù)方的安全性問(wèn)題是其被廣泛應(yīng)用、走向國(guó)際所面臨的主要障礙之一。代謝組學(xué)采用現(xiàn)代儀器分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以對(duì)正常和非正常的生物樣本快速分析，對(duì)毒性靶器官進(jìn)行定位，追溯毒性效應(yīng)的軌跡。早期國(guó)外采用代謝組學(xué)研究?jī)?nèi)容之一就是藥物安全性評(píng)價(jià)及相關(guān)的毒理研究[35,36]。代謝組學(xué)具有系統(tǒng)性、靈敏性、特異性、動(dòng)態(tài)性等特點(diǎn)，將其應(yīng)用到中藥研究領(lǐng)域中可以全面的、客觀的評(píng)價(jià)中藥復(fù)方的安全性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)中藥安全性評(píng)價(jià)的代謝組學(xué)的研究開(kāi)展了大量的工作。本課題組沈淑潔[37]等采用基于液質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)研究了金鈴子散對(duì)大鼠造成亞急性毒性損傷的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高劑量金鈴子散組大鼠中與類固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、賴氨酸代謝、谷胱甘肽代謝及抗血酸代謝等五條代謝通路相關(guān)的44個(gè)代謝物含量發(fā)生了顯著性改變，進(jìn)而對(duì)大鼠機(jī)體造成了明顯的肝腎毒性。

由于中藥復(fù)方是多味中藥配伍組成的，這使得中藥復(fù)方安全評(píng)價(jià)需要研究各味中藥[38]。劉妍如[39]等采用基于NMR的代謝組學(xué)研究了黃藥子致大鼠肝損傷的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)分析0-72 h內(nèi)的尿液發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)中的檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸的含量在給藥組大鼠中呈顯著下降的趨勢(shì)，而甘氨酸的含量呈顯著上升的趨勢(shì)。王小娟[40]等采用基于NMR的代謝組學(xué)對(duì)川楝子毒性的時(shí)效、量效關(guān)系以及3個(gè)極性部位的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示隨著劑量的加大與給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體在得分軌跡圖上代謝軌跡偏離對(duì)照組越多，與空白組比較，高劑量組中檸檬酸、琥珀酸、2-OG、牛磺酸、甜菜堿、甘氨酸水平下降，乳酸、TMAO、肌酸/肌酐水平升高；川楝子各極性部位組代謝物變化相似，乙酸乙酯部位導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶顯著升高、體重顯著下降，是毒性集中部位。Tan[41]等基于LC-Q-TOF-MS的代謝組學(xué)研究了不同劑量的白附片對(duì)大鼠的毒性作用，結(jié)果表明不同劑量的白附片可以導(dǎo)致大鼠體內(nèi)內(nèi)源性代謝物產(chǎn)生不同程度的變化，其中甜菜堿濃度在不同劑量的白附片給藥組中呈上升趨勢(shì)，卵磷脂在不同劑量的白附片給藥組中呈下降趨勢(shì)，并且二者呈劑量依賴性，從而說(shuō)明甜菜堿和卵磷脂可能是白附片產(chǎn)生毒性作用的敏感生物標(biāo)志物；IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析結(jié)果顯示RhoA信號(hào)、膽堿代謝和自由基清除的擾動(dòng)可能是白附片產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制。Wang[42]等人采用基于LC-MS的代謝組學(xué)對(duì)不同劑量狼毒致大鼠毒性損傷進(jìn)行研究，結(jié)果顯示18種氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸類的內(nèi)源性化合物的含量在給藥組中產(chǎn)生了顯著的變化，并呈劑量依賴性；對(duì)代謝物富集后進(jìn)行通路分析，結(jié)果顯示狼毒可能擾亂了大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝，并結(jié)合組織病理學(xué)結(jié)果揭示了狼毒的肝毒性作用，為其致毒機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

2.2 中藥復(fù)方的配伍規(guī)律研究

配伍是中藥復(fù)方的核心關(guān)系，也是中醫(yī)智慧的凝聚。然而“君臣佐使”、“升降沉浮”等配伍理論難以用現(xiàn)代科學(xué)語(yǔ)言全面詮釋清楚，所以中藥復(fù)方的配伍規(guī)律研究成為了中醫(yī)現(xiàn)代化亟需解決的重大問(wèn)題之一。中藥復(fù)方發(fā)揮治療對(duì)應(yīng)證候的效果絕不是單味藥物之間的簡(jiǎn)單加和，而是取決于質(zhì)與量的關(guān)系，不同的質(zhì)與量的組合發(fā)揮的治療效果是不盡相同的。代謝組學(xué)具有高通量、高靈敏等優(yōu)勢(shì)，可以客觀的、無(wú)歧視的反映機(jī)體內(nèi)源性代謝物的代謝輪廓從而反映出其生理狀況，對(duì)于研究中藥復(fù)方中復(fù)雜的“量效關(guān)系”與“組效關(guān)系”是最有效的分析手段[43,44]。

近年來(lái)很多學(xué)者采用代謝組學(xué)研究中藥復(fù)方的配伍規(guī)律并取得了一定的成果。本課題組王小娟[40]等基于NMR的代謝組學(xué)研究了白芍配伍川楝子減毒作用，通過(guò)分析比較川楝子組與川白配伍組大鼠尿液代謝輪廓，發(fā)現(xiàn)與川楝子組相比，配伍組減少了尿液中甲酸、葡萄糖、檸檬酸、琥珀酸、2-OG、肌酸/肌酐、乳酸、谷氨酰胺、TMAO等代謝物的變化；從生化指標(biāo)上看，配伍組與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)氨酶升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，少量肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞變性。為白芍配伍川楝子減毒機(jī)制提供了參考依據(jù)。Wang[45]等運(yùn)用基于UPLC/ESISYNAPT-HDMS代謝組學(xué)研究方法，探討了六味地黃丸其全方、三泄方（澤瀉、茯苓、丹皮）及三補(bǔ)方（熟地、山藥、山茱萸）對(duì)腎虛大鼠內(nèi)源性化合物的影響，結(jié)果顯示三泄組幾乎沒(méi)有療效，三補(bǔ)組有療效但弱于全方組，為其配伍規(guī)律研究提供科學(xué)依據(jù)。Li[46]等采用基于UPLC-QTOF/MS的代謝組學(xué)研究了血虛大鼠在當(dāng)歸、川芎和歸芎藥對(duì)干預(yù)下的血液和尿液代謝變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常大鼠比較血虛大鼠中溶血性磷脂酰膽堿類、鞘胺醇、神經(jīng)酰胺、植物鞘胺醇和甘油磷酸膽堿有上調(diào)趨勢(shì)，油酸、8,11,14-二十碳三稀酸和經(jīng)孕稀醇酮有下調(diào)趨勢(shì)；以上代謝紊亂的內(nèi)源性化合物在當(dāng)歸、川芎、歸芎組大鼠中均向正常狀態(tài)調(diào)轉(zhuǎn)，但川芎藥對(duì)的療效要優(yōu)于兩味單味藥。梁琦[47]等采用基于NMR的代謝組學(xué)研究了廣防己與黃芪配伍后緩解廣防己腎毒性的作用，在給予廣防己、廣防己配伍黃芪4周后測(cè)定大鼠尿液中的內(nèi)源性代謝物，結(jié)果顯示廣防己組尿液中檸檬酸、2-酮戊二酸、葡萄糖、馬尿酸鹽、TMAO、肌酸、肌酐的水平發(fā)生了顯著的變化，而配伍組中這些化合物的水平變化呈不同程度的減?。煌瑫r(shí)腎組織病理檢查結(jié)果顯示配伍組的病變范圍及程度輕于廣防己組，為廣防已配伍黃芪緩解其腎毒性作用提供了病理形態(tài)及分子層面的解釋。

2.3 中藥復(fù)方的作用機(jī)制研究

中藥復(fù)方由多味中藥配伍組成，每味中藥含復(fù)雜的化學(xué)成分，這就決定了中藥復(fù)方具有多組分、多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)。如何闡明中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制是中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究的又一關(guān)鍵問(wèn)題。代謝組學(xué)屬于系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，它把機(jī)體作為一個(gè)整體來(lái)研究，與中醫(yī)整體觀、辨證施治理念十分契合[48]。代謝組學(xué)從內(nèi)、外因素對(duì)生物代謝網(wǎng)絡(luò)影響的角度出發(fā)，具有系統(tǒng)性和動(dòng)態(tài)性，對(duì)中藥復(fù)方的整體療效的評(píng)價(jià)是十分有效的研究方法。李晶晶[49]等采用基于高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)，觀察半夏厚樸湯對(duì)抑郁大鼠尿液中代謝物的影響，結(jié)果顯示空白組、模型組與給藥組的代謝輪廓均有差異；相對(duì)于空白組，模型組中參與能量代謝的檸檬酸、乳酸、2-酮戊二酸含量減少以及馬尿酸、肌酐酸水平升高，而給藥組在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)這種異常改變，表明半夏厚樸湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)以上內(nèi)源性化合物發(fā)揮抗抑郁作用，對(duì)其抗抑郁機(jī)制提供了分子層面的解釋。沈淑潔[50]等基于1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究了半夏厚樸湯鎮(zhèn)靜催眠作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半夏厚樸湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)巴比妥誘導(dǎo)睡眠模型大鼠中的谷氨酰胺、磷酸肌酸、2-酮戊二酸的含量，減輕腦內(nèi)神經(jīng)興奮性從而起到調(diào)節(jié)睡眠的作用。Shui[51]等運(yùn)用基于LC-MS的代謝組學(xué)研究了一貫煎干預(yù)角叉菜膠致炎癥反應(yīng)，生化分析結(jié)果顯示給藥組大鼠血清中的IL-1b、TNF-a、IL-6的水平明顯降低，代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示血清中的膽堿、乙酰膽堿、組氨酸和花生四烯酸等含量顯著下調(diào)以及?；撬?、色氨酸、馬尿酸和黃尿酸等含量顯著上調(diào)，推測(cè)一貫煎通過(guò)調(diào)節(jié)色氨酸代謝、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、乙醛酸-二酸酸代謝及牛磺酸-亞?；撬岽x發(fā)揮抗炎作用機(jī)制。蔡小蓉[52]等采用GC-MS代謝組學(xué)方法研究了a-萘異硫氰酸酯致大鼠黃疸型肝損傷生物標(biāo)志物，并探討了茵陳五苓散治療黃疸型肝損傷的作用機(jī)制，結(jié)果表明模型組大鼠血液中14個(gè)代謝物含量發(fā)生了顯著變化；與空白組比較，高劑量給藥組中琥珀酸、檸檬酸、亞油酸、甘油酸、肌醇的含量無(wú)顯著性差異；高劑量給藥組中絲氨酸、蘇氨酸、花生四烯酸雖未恢復(fù)正常水平，但與模型組呈顯著性差異；推測(cè)茵陳五苓散可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、三羧酸循環(huán)及氨基酸代謝等途徑發(fā)揮干預(yù)大鼠黃疸型肝損傷作用。Tian[53]等采用基于GC-MS的代謝組學(xué)對(duì)健康自愿者與抑郁癥患者以及抑郁癥患者給予逍遙丸前后尿液中的差異性代謝物進(jìn)行了定性、定量分析，結(jié)果顯示與健康者比較，給藥前抑郁癥患者尿液中丙氨酸、馬尿酸、檸檬酸的含量顯著上升，苯丙氨基酸、絡(luò)氨酸的含量顯著下降；而抑郁患者在給予逍遙丸6周后，其尿液中丙氨酸、馬尿酸、檸檬酸的含量均顯著下降，苯丙氨酸、絡(luò)氨酸的含量顯著上調(diào)，推測(cè)逍遙丸可以調(diào)節(jié)機(jī)體的神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸、能量代謝發(fā)揮治療抑郁作用。Song[54]等采用基于NMR的代謝組學(xué)研究了血府逐瘀湯治療高脂飲食致高血脂癥的作用，結(jié)果顯示血府逐瘀湯可以減少機(jī)體內(nèi)的酮體和乙酰糖蛋白的累積，提高谷胱甘肽合成，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)能量代謝、脂質(zhì)代謝，為其發(fā)揮治療高血脂癥作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

3 展望

中藥復(fù)方是中華民族的瑰寶，如何用科學(xué)語(yǔ)言來(lái)闡明中醫(yī)理論和中藥復(fù)方的科學(xué)性是當(dāng)前要致力解決的問(wèn)題。代謝組學(xué)是新興的一門系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)科，具有系統(tǒng)性、靈敏性、特異性和動(dòng)態(tài)性等特點(diǎn)，是一種與中醫(yī)理論不謀而合的現(xiàn)代研究方法，它為中藥現(xiàn)代化研究提供了嶄新的思路。代謝組學(xué)應(yīng)用到中藥復(fù)方領(lǐng)域中來(lái)可以評(píng)價(jià)其整體藥效，將有利于系統(tǒng)地深刻地揭示中藥復(fù)方的內(nèi)涵。近年來(lái)，利用現(xiàn)代分析技術(shù)NMR、LC-MS、GC-MS等代謝組學(xué)技術(shù)已取得了一定的成果，但是代謝組學(xué)是處于發(fā)展的階段的新興學(xué)科，儀器分析技術(shù)、樣品處理方法、數(shù)據(jù)分析的手段等仍需要進(jìn)一步完善。但是筆者相信在隨著各技術(shù)不斷地完善，代謝組學(xué)在中藥復(fù)方研究領(lǐng)域中會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景，也必將推動(dòng)中藥復(fù)方現(xiàn)代化進(jìn)程，使我們更加深刻地理解中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵，更好的傳承和發(fā)展中醫(yī)藥事業(yè)。

以基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物為研究對(duì)象的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)同是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。體內(nèi)小分子內(nèi)源性化合物是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，因此代謝組學(xué)可以獲得與機(jī)體病理狀態(tài)或藥物作用的直接相關(guān)代謝信息。但是要進(jìn)一步驗(yàn)證生物標(biāo)志物、闡明疾病發(fā)生機(jī)制與藥物作用機(jī)理還需結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過(guò)對(duì)各個(gè)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，才能將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為知識(shí)。