中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究進(jìn)展及其應(yīng)用＊

蘇紅娜，張愛華，孫 暉，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心 哈爾濱 150040）

中醫(yī)學(xué)在治療復(fù)雜性多基因疑難雜病方面已經(jīng)凸顯出其方劑配伍聯(lián)合干預(yù)的絕對優(yōu)勢，在經(jīng)典方劑傳承及現(xiàn)代中藥研發(fā)方面也取得了突破性成就，為中國及全球的健康維護(hù)做出了其他醫(yī)學(xué)科學(xué)不可替代的貢獻(xiàn)。然而，由于其理論的復(fù)雜性，其有效性不能以有限的藥理學(xué)等指標(biāo)來表達(dá)清楚，是中醫(yī)理論的科學(xué)價(jià)值及中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的實(shí)用價(jià)值難以被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)乃至于生命科學(xué)家所認(rèn)可和接受，致使中醫(yī)藥有效性的科學(xué)闡釋成為擺在國內(nèi)外現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)家面前難以逾越的障礙，致使中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢及其臨床經(jīng)驗(yàn)的價(jià)值難以充分的發(fā)揮和利用[1]。如何建立一種能夠科學(xué)闡釋中藥方劑有效性及其機(jī)制的生物學(xué)語言，是發(fā)揮中醫(yī)藥在治療復(fù)雜性疾病及個(gè)體化精準(zhǔn)治療方面優(yōu)勢的前提[2]。

中藥方劑有效性包括3個(gè)方面，即臨床效應(yīng)、效應(yīng)機(jī)制及表達(dá)效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。首先，中藥方劑有效性是基于證候表達(dá)的。其次，中醫(yī)臨床用藥形式是方劑，方劑才是藥物，只有在方證對應(yīng)的狀態(tài)下才能表達(dá)臨床療效，單方也是如此。單味中藥飲片僅僅是原料藥，同一中藥飲片在不同的方劑中表達(dá)不同的體內(nèi)成分，從而實(shí)現(xiàn)了配伍的藥效取向。因此，研究中藥有效性必須從證候和方劑入手，在方證對應(yīng)的前提下探討有效性，以往脫離證候和方劑單純研究單一中藥的有效性及藥效成分的工作實(shí)際上已經(jīng)與臨床有效性失之交臂。然而，證候的模糊性及方劑多藥物組成的復(fù)雜性，致使基于證候和方劑開展有效性研究的思路舉步維艱。首先必須闡明證候客觀表達(dá)的生物學(xué)實(shí)質(zhì)，其次才能評價(jià)方劑的效應(yīng)，才能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生效應(yīng)的來源于方劑的體內(nèi)成分，繼而揭示表達(dá)效應(yīng)的機(jī)制[3]。

由此，中醫(yī)方證代謝組學(xué)以證候生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)為切入點(diǎn)，以方劑為研究對象，首先解決證候的生物學(xué)實(shí)質(zhì)，然后再解決方劑體內(nèi)成分分析的問題。即利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定中醫(yī)證候/病生物標(biāo)記物，以證/病的生物標(biāo)記物橋接復(fù)制與證/病關(guān)聯(lián)的動(dòng)物模型，建立方劑藥效生物評價(jià)體系；在闡明方劑有效性的前提下，利用中藥血清藥物化學(xué)技術(shù)，采用與代謝組學(xué)一體化研究策略，分析鑒定有效狀態(tài)下方劑體內(nèi)直接作用物質(zhì)，表征其顯效形式，并將顯效過程中方劑體內(nèi)成分的動(dòng)態(tài)變化與顯效過程中證候生物標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)聯(lián)，挖掘與生物標(biāo)記物軌跡變化高度關(guān)聯(lián)的體內(nèi)成分，從而鑒定表達(dá)方劑臨床療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示作用機(jī)制，解決中藥有效性相關(guān)的系列科學(xué)問題。

1 中醫(yī)方證代謝組學(xué)理論發(fā)展

中醫(yī)藥是數(shù)千年以來人類與自然、疾病的對抗中通過實(shí)踐、不斷總結(jié)各個(gè)時(shí)期的先進(jìn)思想而得出的一套理論體系，同時(shí)也是中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶。然而中醫(yī)以整體、動(dòng)態(tài)、辯證的思維認(rèn)識(shí)疾病以及中藥成分和作用機(jī)制的復(fù)雜性已成為中醫(yī)藥研究的制約因素[4-6]需要建立一種符合中醫(yī)藥特色的方法學(xué)體系，在系統(tǒng)論指導(dǎo)下從整體、動(dòng)態(tài)、功能上詮釋中醫(yī)藥理論的科學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)西醫(yī)和中醫(yī)的相互作用，彌合中西醫(yī)學(xué)的文化差異，促進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國際化發(fā)展[7,8]。

代謝組學(xué)是對內(nèi)源性和外源性小分子物質(zhì)進(jìn)行靶向和非靶向分析的關(guān)鍵技術(shù)，多維定量檢測其整體代謝變化來分析疾病作用機(jī)制的學(xué)科[9,10],可以被理解為生命系統(tǒng)對遺傳或環(huán)境擾動(dòng)的多參數(shù)代謝響應(yīng)的定量測定[11,12]。并結(jié)合先進(jìn)分析技術(shù)，使內(nèi)源性代謝物的改變與生理病理變化關(guān)聯(lián)分析，能夠更精準(zhǔn)地探索機(jī)體的生物機(jī)制、活動(dòng)功能[13-15]。其整體分析的特點(diǎn)符合中醫(yī)的整體觀念，為解決中醫(yī)藥關(guān)鍵科學(xué)問題開辟了一條新途徑[6]。經(jīng)過10余年的發(fā)展，中醫(yī)藥代謝組學(xué)研究取得了顯著成就，從中醫(yī)病/證的代謝輪廓表征及中藥/方劑整體效應(yīng)評價(jià)，中醫(yī)病證生物學(xué)本質(zhì)及中藥方劑作用機(jī)制，再到藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，以及深層次的闡明生物標(biāo)記物功能及中藥有效成分靶向調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制，形成了一種生物學(xué)語言來科學(xué)表達(dá)中藥的療效，這也是進(jìn)一步表述中醫(yī)基礎(chǔ)理論及其臨床實(shí)踐的關(guān)鍵。2011年底，王喜軍教授團(tuán)隊(duì)正式提出中醫(yī)方證代謝組學(xué)（Chinmedomics）方法和研究策略[16]，中醫(yī)方證代謝組學(xué)定義為：以代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)證候的代謝輪廓及生物標(biāo)記物，以證候輪廓及生物標(biāo)記物為指標(biāo)評價(jià)方劑的效應(yīng)，在有效狀態(tài)下，利用中藥血清藥物化學(xué)方法分析鑒定有效狀態(tài)下方劑體內(nèi)成分，并將體內(nèi)成分與證候生物標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)，提取與生物標(biāo)記物軌跡變化高度關(guān)聯(lián)的體內(nèi)成分，從而鑒定表達(dá)方劑臨床療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的應(yīng)用科學(xué)稱為中醫(yī)方證代謝組學(xué)（Chinmedomics）。該創(chuàng)新理論包括4個(gè)核心技術(shù)：基于代謝組學(xué)技術(shù)的代謝生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)；基于代謝生物標(biāo)記物的證候模型制備；利用中藥血清藥物化學(xué)鑒定方劑體內(nèi)直接作用物質(zhì)；外源性方劑顯效成分與內(nèi)源性證候生物標(biāo)記物之間的相關(guān)性分析，共同構(gòu)成了中醫(yī)方證代謝組學(xué)的核心技術(shù)。將中藥血清藥物化學(xué)理論與代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對中醫(yī)證候進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，并對方劑的整體效應(yīng)精準(zhǔn)評價(jià)，解決了與中藥療效相關(guān)的證候生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)，有效狀態(tài)下的中藥體內(nèi)顯效成分表征，及其效應(yīng)機(jī)制等科學(xué)問題[17-19]。中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究方法為中藥有效性和安全性評價(jià)、質(zhì)量控制、臨床證候的診療提供了有效的研究手段。

2 中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究

2.1 中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究證候生物學(xué)本質(zhì)

證候是機(jī)體受到致病因素刺激的情況下產(chǎn)生的綜合性反應(yīng)，是在總結(jié)病因、病機(jī)、病位、病勢的共性基礎(chǔ)上，揭示疾病階段性的病理變化，集中反映疾病的發(fā)展規(guī)律和作用機(jī)制，具有特異性、整體性、動(dòng)態(tài)演變性的特點(diǎn)[20]。辨證論治是指導(dǎo)中醫(yī)臨床正確診療、合理用藥的核心原則，最具有中醫(yī)特色的醫(yī)療手段。然而，由于中醫(yī)證候的復(fù)雜性和研究方法的局限性，對證候的病理機(jī)制和整體特征很難深入研究[21]?；诖酥嗅t(yī)方證代謝組學(xué)從整體出發(fā)，利用高分辨的分析技術(shù)，基于生物網(wǎng)絡(luò)揭示病理生理反應(yīng)以及疾病進(jìn)展中所涉及的潛在分子機(jī)制，揭示不同功能和結(jié)構(gòu)的分子之間的相互作用，使分子含量變化與生物表征相關(guān)聯(lián)并確定證候的生物標(biāo)記物群，揭示證候的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)[22,23]，為證候客觀化提供科學(xué)依據(jù)，中醫(yī)方證代謝組學(xué)不僅有助于理解中醫(yī)證候，也有利于突破中醫(yī)強(qiáng)調(diào)的整體理論和西醫(yī)強(qiáng)調(diào)的還原論，搭建中西醫(yī)結(jié)合的橋梁，拉近了中西醫(yī)之間的距離[24,25]。

中醫(yī)方證代謝組學(xué)已經(jīng)取得了一定的成果，并揭示了腎虛證、黃疸證、實(shí)熱證、心氣虛證等證候以及高脂血癥、肝癌、酒精肝、肥胖等疾病的生物學(xué)本質(zhì)。Fang等人采用先進(jìn)的UPLC-TOF-MS技術(shù)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對陽黃證進(jìn)行整體網(wǎng)絡(luò)分析，揭示其發(fā)病機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)33個(gè)潛在的新型生物標(biāo)記物，涉及到戊糖和葡萄糖轉(zhuǎn)換、?；撬岷蛠喤；撬岽x、初級膽汁酸生物合成和谷胱甘肽代謝。并且發(fā)現(xiàn)其中10個(gè)關(guān)鍵代謝物與臨床陽黃證患者的生物標(biāo)記物具有高度相關(guān)性，因此這些潛在的生物標(biāo)記物在相關(guān)代謝通路的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，可作為治療陽黃證的關(guān)鍵靶點(diǎn)[26]。高脂血癥的主要特征是脂質(zhì)代謝紊亂，并且是心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病因素。中醫(yī)方證代謝組學(xué)分析在早期階段有助于高脂血癥患者的診斷和預(yù)后。因此使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，監(jiān)測高脂血癥患者代謝物和代謝途徑變化。初步鑒定出高脂血癥患者共37個(gè)血清代謝產(chǎn)物。參與11個(gè)代謝途徑，如亞油酸代謝，甘油磷脂等代謝途徑。這些結(jié)果為高脂血癥的早期風(fēng)險(xiǎn)評估提供了潛在的生物標(biāo)記物，并為高脂血癥中復(fù)雜的代謝途徑變化提供了科學(xué)依據(jù)[27]。

2.2 方劑有效性評價(jià)

中藥方劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)將傳統(tǒng)中藥按照“君臣佐使”進(jìn)行配伍，方劑藥效研究可分為藥效評價(jià)和作用機(jī)制，由于中藥方劑的化學(xué)成分多樣性、成分之間相互作用的多樣性、藥理機(jī)制多樣性，難以對方劑效應(yīng)進(jìn)行精準(zhǔn)評價(jià)，因此需要一種技術(shù)科學(xué)地表達(dá)方劑的有效性[28]。基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)，建立方劑藥效生物評價(jià)體系從而評價(jià)方劑對于“證”的整體效應(yīng)，有利于解釋中藥方劑藥效整體性和動(dòng)態(tài)性、配伍規(guī)律性，揭示方劑多靶點(diǎn)的治療機(jī)制。因此中藥方劑的藥效評價(jià)和作用機(jī)制的研究對中醫(yī)藥的實(shí)踐指導(dǎo)和理論發(fā)展具有重要的意義[29,30]。

四君子湯用于治療胃腸疾病、增強(qiáng)免疫的作用。Zhao等人通過結(jié)合NMR和MS代謝組學(xué)方法研究四君子湯對絲裂霉素C誘導(dǎo)免疫毒性的保護(hù)作用。找出10個(gè)關(guān)鍵生物標(biāo)記物參與到氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝中。最主要的代謝通路是天門冬氨酸、丙氨酸、和谷氨酸代謝。揭示了四君子湯對絲裂霉素的免疫毒性的預(yù)防作用，并推測了可能的代謝機(jī)制[31]。黃連解毒湯對腦缺血治療確有療效。為進(jìn)一步明確其治療機(jī)制作用，利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對大腦中動(dòng)脈閉塞組和黃連解毒湯組大鼠的血漿樣品進(jìn)行分析，并結(jié)合HMDB、KEGG和MetaboAnalyst測定這些潛在生物標(biāo)記物的相關(guān)代謝途徑。發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯改善了大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的腦損傷，阻斷了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。鑒定出19個(gè)生物標(biāo)記物，表明通過調(diào)節(jié)谷氨酸代謝，乙酰膽堿水平和功能的基本病理生理網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)黃連解毒湯對腦缺血的治療作用[32]。茵陳蒿湯是治療濕熱黃疸的經(jīng)典方劑[33]，其特點(diǎn)是具有肝臟調(diào)節(jié)作用，緩解黃疸等疾病，尤其是陽黃證。Liu等人基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法通過UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)鑒定了22個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，并結(jié)合多變量分析茵陳蒿湯對陽黃證的功能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵生物標(biāo)記物能有效改善代謝紊亂，闡明了茵陳蒿湯治療陽黃證的有效性[34]。這表明中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)是探索中醫(yī)證候發(fā)病機(jī)制和中藥方劑有效性的有力手段。

2.3 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥或方劑中含有的能夠表達(dá)與中藥或方劑傳統(tǒng)臨床療效相關(guān)的活性化學(xué)物質(zhì)。包括中藥體內(nèi)直接作用物質(zhì)及其前體化合物。它是與中藥有效性、安全性、質(zhì)量控制直接相關(guān)的關(guān)鍵因素。中藥血清藥物化學(xué)是有利于研究中藥活性成分的有效方法，但它僅局限于對化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，由于在體內(nèi)中藥的復(fù)雜成分之間的相互作用，無法整體分析其療效和作用機(jī)制。因此與代謝組學(xué)方法結(jié)合，建立中醫(yī)方證代謝組學(xué)新方法，彌補(bǔ)中藥血清藥物化學(xué)的缺陷。在整體評價(jià)方劑有效性的基礎(chǔ)之上進(jìn)行中藥血清藥物化學(xué)分析，闡明中醫(yī)證候或疾病的生物學(xué)機(jī)制，然后找出中藥體內(nèi)直接作用物質(zhì)，將外源性中藥活性成分與內(nèi)源性證候生物標(biāo)記物的相關(guān)性分析用于闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其協(xié)同機(jī)制[35,36]。

中醫(yī)方證代謝組學(xué)全面反映中藥作用后引起的整體代謝變化，進(jìn)而闡明中藥的作用機(jī)制，符合中醫(yī)藥整體性的特點(diǎn)，其優(yōu)勢是通過中藥多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用來確定中藥發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制和變化規(guī)律，改變了傳統(tǒng)中藥作用機(jī)制研究方法的單成分、單靶點(diǎn)的缺點(diǎn)，可以為闡明中藥作用機(jī)制提供較為科學(xué)合理全面的解釋[37]。近幾年，中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于中藥效應(yīng)關(guān)聯(lián)成分的生物學(xué)功能研究過程。基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法通過UPLC-MS整體分析關(guān)黃柏預(yù)防前列腺癌的有效成分和血清代謝物，在體內(nèi)表征的38個(gè)化合物中，29個(gè)原型入血，并且在體內(nèi)鑒定了9個(gè)代謝物。確定30個(gè)生物標(biāo)記物與前列腺癌相關(guān)，并且黃柏能夠回調(diào)這些擾動(dòng)的代謝物恢復(fù)至正常水平[38]。腎氣丸治療腎陽虛證，通過中藥血清藥物化學(xué)，在體內(nèi)初步表征了34個(gè)成分其中24個(gè)是原型成分，10個(gè)代謝產(chǎn)物。還研究了腎陽虛證的代謝概況和23個(gè)潛在的生物標(biāo)記物。通過對生物標(biāo)記物和入血成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析來篩選20個(gè)高度相關(guān)的有效成分，并將其視為腎氣丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。其中14個(gè)關(guān)鍵的生物標(biāo)記物作為潛在的治療靶點(diǎn)，并與醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收和腎上腺素能信號通路有關(guān)。因此中醫(yī)方證代謝組學(xué)不僅能預(yù)測疾病的治療靶點(diǎn)還能高通量篩選中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對現(xiàn)代中藥研究具有重要意義[39]。

2.4 中藥安全性評價(jià)研究

隨著中醫(yī)藥在國內(nèi)外的快速發(fā)展，由中藥引起的不良反應(yīng)的報(bào)道也日趨增多，如“馬兜鈴酸腎毒性事件”、“黃連素事件”、“小檗堿事件”等等。中藥的毒性是在中藥效應(yīng)表征的同時(shí)對機(jī)體造成的損傷，也是藥物性能的一種，中藥毒性有狹義和廣義之分，狹義的毒性是指藥物對機(jī)體的損傷，而廣義的毒性是指利用藥物的偏性來驅(qū)邪扶正產(chǎn)生療效。因此在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下進(jìn)行方劑配伍可達(dá)到增效減毒的目的。

中藥毒性的現(xiàn)代研究都是集中在急性期和長期毒性研究，毒性物質(zhì)紊亂了內(nèi)源性代謝物的表達(dá)，因此指標(biāo)的選擇局限于生化指標(biāo)檢測和組織病理學(xué)觀察，并缺少與中醫(yī)藥相關(guān)的毒性生物標(biāo)記物的研究，無法闡述藥物在機(jī)體內(nèi)早期的發(fā)生及整個(gè)發(fā)展機(jī)制[40]。近年來，中醫(yī)方證代謝組學(xué)通過核磁共振，氣相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)對生物體毒性標(biāo)記物進(jìn)行定性定量分析[41]，分析與毒性標(biāo)記物相關(guān)的生理病理變化過程，從而發(fā)現(xiàn)由藥物引起的異常代謝變化，由此獲得有關(guān)藥物毒性作用機(jī)制的信息[42]。中醫(yī)方證代謝組學(xué)通過研究有毒中藥及配伍前后對機(jī)體內(nèi)源性標(biāo)記物的影響，闡明有毒中藥的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及復(fù)方配伍前后增效減毒的作用機(jī)制。

烏頭是世界范圍廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥[43]。烏頭具有鎮(zhèn)痛和抗炎活性，其主要藥理活性是烏頭堿型二萜生物堿。Zhao等人利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)研究烏頭區(qū)分于云南省收集的其他七種烏頭屬的標(biāo)記化合物。使用正交偏最小二乘鑒別分析方法，鑒定了8個(gè)標(biāo)記化合物，其中次烏頭堿，新烏頭堿和尼奧靈具有顯著的急性毒性，而附子靈對小鼠沒有急性毒性，表明這種生物堿的相對安全性。此研究說明如何使用代謝組學(xué)方法區(qū)分真正的藥用植物和普通摻雜物，并鑒定可能開發(fā)成新藥的化合物[44]。草烏是烏頭的塊根，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)疼痛和腫瘤等疾病。然而，草烏引起的心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性限制了其應(yīng)用。因此通過尿液代謝組學(xué)鑒定了草烏誘導(dǎo)的心臟和肝臟毒性相關(guān)的13個(gè)生物標(biāo)記物，其中有5個(gè)生物標(biāo)記物在烏頭屬中共同擁有。利用代謝組學(xué)結(jié)合模式識(shí)別方法分析草烏與甘草、白芍和人參配伍的減毒機(jī)制。在這項(xiàng)工作中強(qiáng)調(diào)了代謝組學(xué)結(jié)合模式識(shí)別分析，可以用于評估藥物毒性和配伍減毒方法[45]。為了研究金瓜花肝毒性，Wang等人基于UPLC-MS將細(xì)胞代謝組學(xué)與血清藥理學(xué)相結(jié)合對人HL-7702肝細(xì)胞進(jìn)行研究，并確定了7個(gè)生物標(biāo)記物。此外，確定了參與溶血磷脂酰膽堿的生物合成途徑和鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸途徑的兩種信號分子和四種酶，分析了與特定生物標(biāo)記物和兩種代謝途徑相關(guān)的代謝過程，以揭示金瓜花肝毒性可能的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激，溶血磷脂酰膽堿途徑，以鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸途徑和脂肪酸代謝為中心的鞘氨醇-1-磷酸代謝譜的干擾可能是金瓜花引起的肝損傷的關(guān)鍵因素[46]。

2.5 中藥質(zhì)量標(biāo)志物研究

中藥是中醫(yī)治療疾病的基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響功效和安全性，然而中藥質(zhì)量控制一直是全球范圍內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)[47]。由于中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相互作用、采收、加工、運(yùn)輸、提取、凈化等過程，還有中藥研究思路和技術(shù)的局限性都會(huì)影響中藥質(zhì)量評價(jià)。因此2016年，劉昌孝院士首次提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的概念及其基本條件[48]，確立能夠反映中藥安全性和有效性的質(zhì)量標(biāo)志物的中藥質(zhì)量控制體系[49]。中藥質(zhì)量標(biāo)志物的基本條件：1、傳遞性與溯源性2、成分有效性3、成分特有性4、成分可測性5、復(fù)方配伍規(guī)律。提出基于“五原則”的復(fù)方中藥質(zhì)量標(biāo)志物研究和發(fā)現(xiàn)的路徑。既反映了中藥質(zhì)量標(biāo)志物與有效性和安全性的關(guān)聯(lián)性，又體現(xiàn)方劑配伍，進(jìn)一步找出中藥有效狀態(tài)下的顯效成分以此作為質(zhì)量標(biāo)志物才能提高臨床用藥價(jià)值[50]。

中藥的化學(xué)成分非常復(fù)雜，是種類繁多、結(jié)構(gòu)各異的代謝產(chǎn)物的合集，僅僅對單一藥物或者某一成分進(jìn)行分析無法滿足質(zhì)量控制的準(zhǔn)確性和整體性，并且難以通過傳統(tǒng)的技術(shù)手段進(jìn)行全面分析。因此采用中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)高通量分析中藥整體代謝物組，確定整體表征的質(zhì)量標(biāo)志物，并將這些質(zhì)量標(biāo)志物投影到中藥治療的“疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，建立以成分為中心、藥效為重心、質(zhì)量為核心的“物-量-效”群，用于中藥的質(zhì)量控制，對提高中藥臨床用藥準(zhǔn)確性具有重要意義[51]。

生脈散已被廣泛用于治療氣陰兩虛證，改善認(rèn)知功能障礙。然而，生脈散的質(zhì)量標(biāo)志物仍需要進(jìn)一步研究。Zhang等人利用代謝組學(xué)方法表征生脈散治療阿爾茨海默病的相關(guān)尿液代謝標(biāo)記物，并應(yīng)用中藥血清藥物化學(xué)來分析生脈散的體內(nèi)顯效成分，通過中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法將阿爾茨海默病相關(guān)的代謝標(biāo)記物與生脈散的體內(nèi)直接作用物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)生脈散對APP/PS1小鼠具有很好療效，能夠回調(diào)4個(gè)潛在的尿液生物標(biāo)記物，共檢測到17個(gè)體內(nèi)成分，包括14個(gè)原型成分和3個(gè)代謝產(chǎn)物。相關(guān)性分析顯示五味子素、異長春花苷等8個(gè)成分與生脈散治療阿爾茨海默病極為相關(guān)，被認(rèn)為是生脈散的潛在質(zhì)量標(biāo)志物[52]。一些研究已經(jīng)表明茵陳蒿湯的藥理活性和組分。然而，其質(zhì)量標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)尚未揭示。采用高靈敏度UPLC-MS技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別方法分析血清樣本和尿液樣本。多變量數(shù)據(jù)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)用于鑒定與治療效果相關(guān)的有效成分和生物標(biāo)記物。結(jié)果，在茵陳蒿湯中共鑒定出69個(gè)化合物，其中41個(gè)入血成分。此外，還鑒定了濕熱性黃疸證的34個(gè)尿液生物標(biāo)記物。基于高通量的中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法，將尿液生物標(biāo)記物和入血成分進(jìn)行相關(guān)性分析最后確定9個(gè)關(guān)鍵化合物作為茵陳蒿湯的質(zhì)量標(biāo)志物。最后，共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。中醫(yī)方證代謝組學(xué)提供了一種有利的方法來闡明中藥的有效性，是發(fā)現(xiàn)中藥質(zhì)量標(biāo)志物的新策略[53]。

2.6 中醫(yī)方證代謝組學(xué)與腸道微生態(tài)相關(guān)研究

研究者們不斷強(qiáng)調(diào)腸道微生物群對人類健康的影響，因?yàn)槿梭w腸道的盤旋構(gòu)造被稱為人體的第二大腦，并攜帶著人體“第二基因”，并切擁有500至1000種的100萬億個(gè)細(xì)菌，占體重的1-3%，編碼超過4 M的基因，它們是機(jī)體內(nèi)最重要的一種外環(huán)境，各種微生物之間的互相聯(lián)系形成一種生態(tài)平衡。腸道菌群可以作為具有巨大代謝能力的生物反應(yīng)器并且在許多生物功能方面與宿主相互作用形成共生的超級有機(jī)體[54]，按照菌群的特性，它們可分為：與宿主共生的有益菌；與宿主共棲的致病菌；病原菌。當(dāng)人體復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)失去平衡之后，導(dǎo)致菌群失調(diào)，免疫力下降，引發(fā)多種疾病。研究表明，腸道菌群對宿主生理功能有著重要的影響，包括體內(nèi)代謝、營養(yǎng)平衡、免疫系統(tǒng)，甚至是大腦活動(dòng)。這些效應(yīng)是由細(xì)胞間的相互作用、微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或環(huán)境和宿主分子轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的代謝物來介導(dǎo)的，產(chǎn)生的分子能夠與宿主的生理功能相互作用，并在局部和遠(yuǎn)端發(fā)生反應(yīng)，因此腸道菌群失調(diào)可能是疾病發(fā)病機(jī)制的起始或強(qiáng)化因素[55,56]。

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，由于細(xì)菌的多重耐藥性導(dǎo)致抗生素有效性降低。新型抗菌藥物不太可能在短期內(nèi)廣泛使用。對于腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，中藥多成分、多靶點(diǎn)的特征占據(jù)了很大的優(yōu)勢[57]。腸道微生態(tài)學(xué)與中醫(yī)學(xué)盡管存在著形式上的不同，但是兩者都是從多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)境去探究機(jī)體與環(huán)境之間的整體規(guī)律。中醫(yī)的整體觀、臟腑學(xué)說及陰陽失調(diào)等諸多方面與腸道微生態(tài)學(xué)理論相通并存在著緊密的聯(lián)系[58,59]。鑒于腸道菌群全面參與宿主的生理病理過程，所以研究者們表明腸道菌群能夠作為中藥治療的主要靶點(diǎn)，其通過多組分發(fā)揮整體效應(yīng)將生理調(diào)節(jié)至正常狀態(tài)[60]。大量研究表明由于腸道菌群與中藥的復(fù)雜相互作用，這些相互作用包括：腸道菌群將中藥轉(zhuǎn)化為具有差異性生物利用度和差異性生物活性/毒性的代謝物；中藥中含有的化學(xué)成分改善腸道菌群的組成，從而改善其功能障礙以及相關(guān)的病理狀況；腸道菌群介導(dǎo)中藥中多種化學(xué)成分之間的相互作用（協(xié)同和拮抗）[61]，因此中藥能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群的異常狀態(tài)，對腸道菌群失調(diào)所導(dǎo)致的病證有著較好的臨床療效。

在正常情況下，腸道微生物之間的聯(lián)系與作用維持著內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而且與機(jī)體的生理病理狀態(tài)密切相關(guān)，是機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的一部分。因此僅利用宏基因組學(xué)分析DNA層面，不能很好地研究微生物組的功能情況。從而應(yīng)用代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)等多組學(xué)研究的技術(shù)[62]，其中代謝組學(xué)與腸道菌群結(jié)合，并對人體腸道菌群代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，了解中醫(yī)病證下的腸道菌群的改變及代謝狀態(tài)，并且闡明在疾病狀態(tài)下中藥對腸道菌群的作用機(jī)制。

在一項(xiàng)研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和功能代謝組學(xué)的結(jié)合來研究芒硝通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝治療結(jié)腸直腸癌的機(jī)制?；诖x組學(xué)通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合多變量模式識(shí)別分析，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)記物位于膽汁酸代謝的相關(guān)途徑中，例如?；撬?，鵝去氧膽酸，膽酸和脫氧膽酸。表明芒硝在調(diào)節(jié)膽汁酸相關(guān)生物標(biāo)記物達(dá)到了抑制結(jié)直腸癌中的作用，進(jìn)一步揭示了結(jié)腸直腸癌的代謝紊亂并解釋芒硝的治療效果[63]。脾陽虛證是中醫(yī)常見的疾病，它是一種復(fù)雜的表型，反映胃腸道消化功能紊亂所引起的代謝改變，Zhang等人基于LC-Q-TOF/MS的代謝組學(xué)和16s rRNA測序方法，對脾陽虛患者和健康個(gè)體的血漿、尿液和糞便進(jìn)行綜合代謝和微生物分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康組相比脾陽虛患者的腸道菌群失調(diào)與代謝紊亂密不可分，將腸道細(xì)菌的差異性與代謝產(chǎn)物綜合分析，結(jié)果表明擬桿菌門減少、厚壁菌門增多，并鑒定出一些活性細(xì)菌參與宿主粘膜完整性、膽汁酸代謝和多糖分解。因此表明腸道菌群可能參與調(diào)節(jié)代謝變化，有助于進(jìn)一步研究腸道菌群在脾陽虛證發(fā)病機(jī)制中的作用[64]。

3 總結(jié)

近年來，科學(xué)家逐漸認(rèn)識(shí)到代謝組學(xué)可以作為中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)之間的橋梁，在中醫(yī)臨床研究中取得了巨大進(jìn)步，有助于闡明中醫(yī)證候的本質(zhì)和作用機(jī)制。特別在21世紀(jì)，中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究方法有利于促進(jìn)中醫(yī)藥學(xué)的國際化發(fā)展，開創(chuàng)了中醫(yī)藥系統(tǒng)評價(jià)的新局面，它結(jié)合現(xiàn)代先進(jìn)的分析技術(shù)，力圖揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制這個(gè)復(fù)雜的“黑箱體系”。使人們對中醫(yī)藥有了全新的認(rèn)識(shí)，開辟了中醫(yī)藥治療和開發(fā)的新途徑，從而推進(jìn)中醫(yī)藥的科學(xué)化、現(xiàn)代化和國際化發(fā)展。