Notch信號(hào)通路及其與肝癌相關(guān)性的研究進(jìn)展＊

周 煜，薛淑一，李明春

Notch基因首次由Morgan及其同事于1917年發(fā)現(xiàn)，他們觀察到該基因部分功能缺失會(huì)造成果蠅株翅膀的邊緣缺刻，因此命名為Notch基因。直到20世紀(jì)80年代中期，Artavanis－Tsakonas研究小組才首次克隆出Notch基因。Notch信號(hào)通路是一條極其復(fù)雜的調(diào)控通路，調(diào)控機(jī)體內(nèi)多細(xì)胞的分化、增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，幾乎涉及所有的器官和組織。因此，Notch信號(hào)通路的異?；罨瘜?dǎo)致了大量的人類(lèi)疾病從發(fā)育綜合征到成人疾病，甚至是多種惡性腫瘤［1－3］。 因此，對(duì)其進(jìn)行深入的研究顯得十分重要。

肝癌是全世界最常見(jiàn)和導(dǎo)致人類(lèi)高病死率的惡性腫瘤之一［4］，給人類(lèi)的生命和社會(huì)的發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。其中有一半的病例和病死者發(fā)生在中國(guó)［5，6］，且呈逐年上升的趨勢(shì)，中國(guó)面臨的肝癌形勢(shì)日益嚴(yán)峻，也是研究人員重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一，但目前對(duì)肝癌信號(hào)通路的研究尚不清晰。因此，深入研究肝癌信號(hào)通路，尋找有效治療方法，在肝癌的預(yù)防和治療中顯得尤為重要。近年來(lái)，Notch信號(hào)通路成為肝癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，該條信號(hào)通路有望成為肝癌治療的新型生物靶點(diǎn)［7，8］。 在此，該文就Notch信號(hào)通路的組成，Notch信號(hào)通路的調(diào)控以及Notch信號(hào)通路在肝癌中作用研究做一綜述。

1 Notch信號(hào)通路的作用

Notch信號(hào)通路廣泛表達(dá)于從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物，是一條進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，它處于復(fù)雜的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之中。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞譜系定型、分化、周期進(jìn)程、增殖、凋亡的過(guò)程中起著重要的作用。Notch信號(hào)對(duì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的行為有重大影響，并影響其功能［9］。Notch信號(hào)通路的活化可以刺激細(xì)胞進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換或阻止進(jìn)一步的分化來(lái)維持原有的表型。Notch信號(hào)通路在不同的組織或細(xì)胞背景下，有不同的作用，即使Notch信號(hào)通路在同一組織中不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)，也表達(dá)出不同的角色和行為，這取決于Notch信號(hào)通路所處的位置。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Notch信號(hào)通路與腫瘤之間存在著一些聯(lián)系，Notch信號(hào)通路在許多腫瘤中發(fā)生改變，導(dǎo)致在其他致癌信號(hào)通路中激活或抑制該通路。Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)也可以抑制癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)［10，11］。

2 Notch信號(hào)通路的組成

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子（CSL蛋白）組成。

2.1 受體 果蠅中只有1個(gè)Notch受體，線蟲(chóng)中有2個(gè)Notch受體，哺乳動(dòng)物中有4個(gè)同源Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4），Notch 受體為 I型跨膜蛋白，由胞外域（NEC）和胞內(nèi)域（NTM）組成，胞內(nèi)域可分為跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（ICN）兩部分。NEC是與配體結(jié)合的區(qū)域，包含多個(gè)表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列 （epidermal growth factor-like repeats，EGF）和三個(gè)富含半胱氨酸的LIN12-Notch重復(fù)序列（LIN12-Notch repeats）和異二聚體結(jié)構(gòu)域（heterodimerization domain，HD）組成的負(fù)性調(diào)控區(qū)（negative regulatory region，NRR）［12］。 哺乳動(dòng)物中Notch1和Notch2均有36個(gè)表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列，Notch3和Notch4分別含有34和29個(gè)表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列。Notch（1~4）受體的差別主要集中在表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列（29~36）上，這些差別是重要的，通過(guò)鄰-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶將表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列上特定的絲氨酸和蘇氨酸殘基上巖藻糖基化，這是受體與配體有效結(jié)合所必需的［13］。這些O-巖藻糖部分可以通過(guò)由N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的邊緣家族添加N-乙酰氨基葡萄糖來(lái)延長(zhǎng)，這些修飾增加了Notch受體對(duì)某些配體的親和力。Notch受體的11~12表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列與配體的24~29表皮生長(zhǎng)因子的重復(fù)序列相互作用。許多EGF重復(fù)序列結(jié)合鈣，其在確定結(jié)構(gòu)和Notch受體對(duì)其親和力方面起著重要作用。NRR阻止受體未與配體結(jié)合的情況下，獨(dú)自活化。NTM在Notch信號(hào)通路中發(fā)揮著與下游效應(yīng)蛋白的相互作用、核定位和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等關(guān)鍵作用，它由RBPJk 關(guān)聯(lián)分子（RAM）域、核定位序列（NLS）、錨蛋白重復(fù)序列（ANK）、轉(zhuǎn)錄域（TAD）、C 末端含有脯氨酸、谷氨酸，絲氨酸和蘇氨酸豐富的多肽（PEST）域組成。在Notch3和Notch4受體中未發(fā)現(xiàn)TAD［14］。PEST域負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)蛋白的更新，果蠅Notch還富含谷氨酰胺的OPA重復(fù)序列。

2.2 配體 哺乳動(dòng)物中有兩類(lèi)五種Notch配體，Serrate 樣配體（JAG1、JAG 2），Delta 樣配體（DLL1、DLL 3、DLL 4），它們統(tǒng)稱為 DSL蛋白。 Notch配體同樣為I型跨膜蛋白。Notch配體由N末端的DSL域、串聯(lián)EGF重復(fù)序列的DOS域、EGF重復(fù)序列三部分組成［15］。Serrate樣配體靠近細(xì)胞膜的部位有一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，Delta樣配體無(wú)此結(jié)構(gòu)域。DSL和DOS域參與了受體結(jié)合，DSL域是Notch信號(hào)通路激活所必需的，DSL域還參與了Notch的反式和順式相互作用。DSL域可以基于存在/缺失富含半胱氨酸域和DOS域進(jìn)行分類(lèi)。在5種配體中，DLL 3表現(xiàn)出與其他配體明顯的結(jié)構(gòu)差異，在反式體中似乎不能激活Notch信號(hào)通路。因此，DLL3激活Notch信號(hào)通路的一些功能意義有待于進(jìn)一步的研究［16］。

2.3 細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子 CSL蛋白［哺乳動(dòng)物中為CBF-1 （C-promoter binding protein-1）， 果蠅中為Su（H）（Suppressor of Hairless），線蟲(chóng)中為 Lag1］中的 CBF-1（C-promoter binding factor-1）在哺乳動(dòng)物中又稱為RBP-JK （recombination signal binding protein-Jk），是轉(zhuǎn)錄抑制因子，能夠識(shí)別并與特定的DNA 序列“GTGGGAA”結(jié)合，招募 SMRT，SKIP，Ⅰ/Ⅱ型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种莆?，防止下游靶基因獨(dú)自活化。在Notch信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。Notch蛋白的活化形式-NICD（ICN）進(jìn)入細(xì)胞核后，ICN中的RAM和ANK結(jié)構(gòu)域與之結(jié)合，并招募共激活因子，如操縱子樣蛋白家族（mastermindlike family members，MAML），解除轉(zhuǎn)錄抑制，激活轉(zhuǎn)錄［17］。

3 Notch信號(hào)通路的激活

Notch信號(hào)通路由兩個(gè)相鄰細(xì)胞的Notch受體與配體相互作用而激活，這是激活Notch信號(hào)通路的必要條件。Notch信號(hào)通路的激活要經(jīng)過(guò)3次酶切割。Notch受體前體蛋白在核糖體合成以后，在高爾基體內(nèi)被furin蛋白酶于S1位點(diǎn)進(jìn)行第一次裂解，形成NEC和NTM兩個(gè)亞基，它們通過(guò)二硫鍵連接形成異二聚體形式的成熟Notch受體，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，第一次裂解的功能意義仍有待于進(jìn)一步研究。當(dāng)受體與配體結(jié)合以后，配體誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，TM之前位于12個(gè)氨基酸并深埋在NRR內(nèi)的S2位點(diǎn)被暴露，被腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶（tumour necrosis factor-α -converting enzyme，TACE;也被稱為ADAM17）裂解為2個(gè)片段，S2裂解是缺口激活中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟［18］，N端裂解片段（NEC）被配體細(xì)胞所吞噬，C端裂解片段在S3位點(diǎn)被早老素-γ-secretase復(fù)合體釋放Notch蛋白的活化形式 NICD（Notch intracellular domain，NICD），早老素-γ-secretase復(fù)合體由 presenilin 1 （PSEN1），PSEN 2，nicastrin （NCSTN），presenilin enhancer 2（PEN2）和 APH1 組成［19］，NICD 進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因。NICD通過(guò)磷酸化和蛋白酶降解快速失活，該信號(hào)通過(guò)配體誘導(dǎo)的新的NICD的蛋白水解來(lái)維持。沒(méi)有第二信使參與擴(kuò)增Notch信號(hào)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致Notch信號(hào)在細(xì)胞傳導(dǎo)過(guò)程中沒(méi)有增強(qiáng)或減弱，從而使細(xì)胞對(duì)Notch信號(hào)活動(dòng)的微小變化敏感。

4 Notch信號(hào)通路與肝癌

許多研究已經(jīng)表明，Notch信號(hào)通路是雙向調(diào)控通路，它在不同的狀態(tài)下發(fā)揮完全相反的作用，Notch信號(hào)通路在不同腫瘤和腫瘤發(fā)展的不同階段時(shí)，Notch可以作為致癌基因或者抑癌基因，在慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL），非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出致癌作用［10，20-22］，但在急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML），鱗狀細(xì)胞肺癌和鱗狀細(xì)胞皮膚癌中表現(xiàn)出抑癌作用［23，24］。 此外，Notch 在高惡性宮頸癌中低表達(dá)而在低惡性中卻高表達(dá)。Notch信號(hào)在肝癌中起著重要的作用，它調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。但是，激活Notch信號(hào)通路到底是抑制或者促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)仍存在爭(zhēng)議，盡管有一些令人信服的證據(jù)表明，Notch信號(hào)通路的激活，促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)［25］，但一些專家持相反的意見(jiàn)［26］，造成這種沖突的原因，很可能是由于Notch信號(hào)通路是細(xì)胞背景依賴性的［27］。

Notch信號(hào)通路的激活對(duì)于膽管板重塑和小管形成是必需的，它們的形成是膽管發(fā)育的主要步驟［28］。在Notch信號(hào)通路缺失的遺傳病癥中，肝臟核因子 1β（hepatic nuclear factor1β，HNF1β）缺乏，導(dǎo)致膽道細(xì)胞無(wú)反應(yīng)及肝膽細(xì)胞無(wú)法聚集，影響膽道的修復(fù)，從而形成Alagille綜合征（Alagille syndrome，AGS），臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的膽管發(fā)育不良和膽汁淤積以及多種肝外表現(xiàn)，這表明Notch信號(hào)通路是人肝臟修復(fù)的重要調(diào)節(jié)因子［29］。在敲除Notch1基因的小鼠中，Notch1的缺失不足以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，卻促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致發(fā)展為結(jié)節(jié)性增生，表明Notch信號(hào)通路的抑制了HCC細(xì)胞的增殖和肝癌的生長(zhǎng)［30］。

對(duì)HCC患者進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)Notch1基因高表達(dá)的患者有更好的預(yù)后。有文獻(xiàn)報(bào)道［31］，檢測(cè)了Notch受體在肝癌與正常肝組織中的表達(dá)，肝癌組織中，Notch1、Notch2、Notch3 的表達(dá)下調(diào)， 表明Notch信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

在SMMC7721細(xì)胞中，Notch1誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制與 G0/G1細(xì)胞周期阻滯，cyclin A，cyclin D1，cyclin E，和 cdk4上調(diào)相關(guān)［32］。在HepG2肝癌細(xì)胞中，Notch1信號(hào)通路激活后，p21表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞周期表型分布和生長(zhǎng)抑制緊密相關(guān)的高度磷酸化的Rb蛋白表達(dá)下降，導(dǎo)致G0/G1細(xì)胞周期阻滯從而抑制生長(zhǎng)。Notch信號(hào)通路激活導(dǎo)致G2細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡可能與RB家族基因失活使TKO成纖維細(xì)胞G2細(xì)胞周期阻滯相關(guān)［33］。在細(xì)胞周期阻滯后，通過(guò)p53依賴性途徑，Notch1信號(hào)通路減少Bcl-2信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改變了p53與Bcl-2的平衡，抑或是Notch1信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡配體，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)而發(fā)揮抑癌作用［34］。也有文獻(xiàn)報(bào)道稱，Notch1的過(guò)表達(dá)，磷酸化JNK （c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路，從而活化JNKMAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而抑制肝癌生長(zhǎng)。JNK（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因，包括 Bcl-2、bax［35］。

最近有研究表明，Notch1在肝癌（human hepatocellular carcinoma，HCC）中作為促癌因子，在人肝癌組織中，發(fā)現(xiàn)Notch激活表達(dá)。在NICD小鼠模型（Notch信號(hào)通路中NICD上調(diào)）中，Notch1信號(hào)通路激活誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生［36］。Notch1異常表達(dá)與HCC轉(zhuǎn)移性疾病密切相關(guān)，并且在Notch1敲除小鼠模型中HCC腫瘤轉(zhuǎn)移被抑制［37］。在小鼠模型中，Notch2激活時(shí)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)［38］。有文獻(xiàn)報(bào)道，與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中的Notch1 高表達(dá)，Notch2 與 Notch3 表達(dá)無(wú)明顯差異［39］。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，與周?chē)斡不M織相比，腫瘤細(xì)胞中Notch1和Notch3的異常核表達(dá)［40］。在晚期肝癌階段，細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，Notch信號(hào)通路在細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用［41］。研究表明，Notch1的高表達(dá)表明Notch信號(hào)通路具有癌變的作用。

在HepG2細(xì)胞中，Notch1激活增加S和G2M期細(xì)胞的數(shù)量，在SMMC7721細(xì)胞中，抑制Notch1時(shí)，細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明Notch1激活促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖［42］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在HCC細(xì)胞中，p53過(guò)表達(dá)，共激活Notch1-Snail信號(hào)通路導(dǎo)致侵襲和增殖增加［43］。此外，在HCC細(xì)胞中，經(jīng)由p53依賴性通路，沉默的Notch3增強(qiáng)了阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的敏感性。在SMMC7721細(xì)胞中，TNF－α通過(guò)IKKα和FOXA2轉(zhuǎn)錄因子，減少Notch抑制物Numb表達(dá)［25］。抑制FOXA2是許多炎癥病癥的顯著特征，可能代表慢性炎癥與癌癥之間的分子聯(lián)系。這些研究證據(jù)表明，在HCC中，Notch信號(hào)通路的致癌作用是依賴于與其他通路 （p53，Snail，TNFα/IKKα/FOXA2/NUMB）的合作，并被炎癥微環(huán)境所調(diào)節(jié)［44］。有許多研究證據(jù)表明，在肝癌中，Igf2和Sox9是共致癌部分。在乳腺癌，卵巢癌和結(jié)腸直腸癌中Igf2強(qiáng)烈上調(diào)，提高了Igf2在這種情況下作為Notch致癌的可能性。在與胚胎干細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Nanog相關(guān)的HCC癌癥干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Igf2上調(diào)，Igf2啟動(dòng)子和Igf2上調(diào)都是人類(lèi)HCC公認(rèn)的特征［45，46］。 Notch 誘導(dǎo)的所有腫瘤中顯示 Notch的靶基因Sox9有不同程度的核染色，并且在人類(lèi)肝癌中頻繁觀察到Sox9過(guò)表達(dá)，特別是在Notch誘導(dǎo)的那些腫瘤。最近的一項(xiàng)研究表明，Sox9是肝臟內(nèi)的多能群體，因此，在肝癌發(fā)生過(guò)程中，Notch可能通過(guò)擴(kuò)增先前存在的祖細(xì)胞或賦予分化細(xì)胞祖細(xì)胞樣特性而發(fā)揮作用［47］。

Notch信號(hào)通路促進(jìn)或抑制肝癌的生長(zhǎng)可能是與其他信號(hào)通路的串?dāng)_的結(jié)果，Notch信號(hào)通路的激活改變了其他多條信號(hào)通路的途徑，其他蛋白又負(fù)反饋調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖，凋亡或促進(jìn)細(xì)胞分化。

綜上所述，Notch信號(hào)通路是一條介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用來(lái)調(diào)節(jié)生物體生長(zhǎng)發(fā)育的一條保守的信號(hào)通路，在細(xì)胞命運(yùn)決定、胚胎發(fā)育、器官組織的形成各個(gè)環(huán)節(jié)起著重要的作用。Notch信號(hào)通路與肝癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、密切相關(guān)，但是由于Notch信號(hào)通路是一條復(fù)雜的多維調(diào)控通路，Notch信號(hào)通路與其他信號(hào)通路互相關(guān)聯(lián)，互相影響，Notch信號(hào)通路在肝癌中的具體分子機(jī)制仍不清晰，雖然一些Notch信號(hào)通路在肝癌中的作用已初步達(dá)成共識(shí)，但在肝癌發(fā)展中的具體作用機(jī)制仍有巨大爭(zhēng)議，有些研究認(rèn)為Notch信號(hào)通路在肝癌中有時(shí)起抑癌作用，另一些研究認(rèn)為Notch信號(hào)通路在肝癌中有時(shí)起促癌作用，所以必須研究清晰Notch信號(hào)通路在肝癌中的具體分子機(jī)制。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，人們對(duì)遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及信號(hào)通路的不斷研究深入，定會(huì)明確Notch信號(hào)通路在肝癌中的分子機(jī)制，這將為肝癌靶向治療研究開(kāi)辟新的途徑，為肝癌患者帶來(lái)福音。