miR-449a對上皮后囊混濁晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制

徐曉瑋，田愛軍，陳紅，郝微

(河北省眼科醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001)

后囊渾濁是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)繼發(fā)性視力喪失[1]。研究顯示，后囊混濁的發(fā)生與術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等過程有關(guān)[2]。miRNA在許多疾病發(fā)生及多種細(xì)胞生理狀態(tài)變化中發(fā)揮重要作用，包括晶狀體上皮細(xì)胞凋亡、遷移、增殖和EMT[3]。研究結(jié)果顯示，miR-26b高表達(dá)抑制晶狀體上皮細(xì)胞遷移和EMT，減少白內(nèi)障術(shù)后后囊混濁發(fā)生[4]。并且miRNA靶向酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡[4]，影響上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[5]。miRNA通過調(diào)節(jié)c-Myc基因的表達(dá)影響膀胱癌細(xì)胞EMT。miR-449a可靶向抑制c-Myc的表達(dá)從而增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的放療耐受性[6]。miR-449a通過抑制EMT抑制胃癌細(xì)胞的侵襲[7]。但miR-449a在晶狀體上皮細(xì)胞中的作用尚未見報(bào)道。2017年11月～2018年6月，本研究對miR-449a在晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移及EMT中的作用進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 后囊混濁組織晶狀體上皮細(xì)胞(PCO-LECs)及正常附著組織晶狀體上皮細(xì)胞(normal-LECs)由中國北京眼庫提供；人胚腎細(xì)胞(HEK-293T)購自北京北納生物科技有限公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；TRIzol、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自中國大連Takara公司；Pierce BCA Protein Assay Kit購自美國Pierce公司；MTT試劑盒及RIPA緩沖液購自上海碧云天公司；PVDF膜購自美國Life Technologies公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自廣州賽哲生物科技股份有限公司；miR-449a mimics、scrambled序列、3′UTR突變型c-Met/c-Myc和野生型c-Met/c-Myc購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將晶狀體囊分散于培養(yǎng)皿上，使內(nèi)皮細(xì)胞向上。將胎牛血清滴到內(nèi)皮細(xì)胞表面，使晶狀體上皮細(xì)胞充分附著于培養(yǎng)皿表面。加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，并添加10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。

1.3 晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)PCO-LECs細(xì)胞滿度為80%～90%時(shí)，按照3×105/mL將細(xì)胞接種于6孔板中。按照操作說明采用LipofectamineTM2000向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-449a特異性的mimics(mimics組)以及scrambled序列作為對照組(miR-NC組)。

1.4 晶狀體上皮細(xì)胞miR-449a及上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、纖黏蛋白(fibronectin)表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法檢測細(xì)胞miR-449a表達(dá)，按照生產(chǎn)廠家的使用說明書收集組織或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以TRIzol試劑盒提取細(xì)胞或組織中的總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，分析晶狀體上皮細(xì)胞miR-449a表達(dá)。miR-449a上游引物序列：5′-TGGCGGTGGCAGTGTATTGTTA-3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；采用GAPDH作為內(nèi)參，其上游引物序列：5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物序列：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。反應(yīng)體系： 2×SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 7.5 mL，引物混合物0.6 mL， cDNA模板1 mL，ddH2O 5.9 mL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s循環(huán)40次，95 ℃處理1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、fibronectin蛋白表達(dá)。將稀釋后的樣品50 μL加入反應(yīng)孔，立即加入生物素標(biāo)記的抗體50 μL，蓋上膜板，室溫震蕩孵育45 min，洗滌，振蕩30 s，重復(fù)操作3次，加入標(biāo)記的HRP 100 μL，再次孵育30 min，洗滌，振蕩30 s，重復(fù)操作3次。然后加入顯色底物，在酶標(biāo)儀下讀取各孔吸光度值。

1.5 晶狀體上皮細(xì)胞增殖活力檢測 采用MTT法。轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，并采用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞配成單細(xì)胞懸浮液，以1×104/孔接種于96孔板，每孔體積為200 μL。在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入CPT-11，在相同條件下孵育24 h，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL。孵育4 h后，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min使結(jié)晶物完全溶解，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm處各孔吸光度值。

1.6 晶狀體上皮細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell法。將1×105個(gè)細(xì)胞接種在含無血清DMEM培養(yǎng)基的上室中，之后向下室中加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)48 h后，采用棉絮擦拭以去除上室中非侵襲性細(xì)胞。用4%多聚甲醛處理膜的下表面，固定遷移細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫溶液在室溫條件下進(jìn)行染色。隨機(jī)取5個(gè)視野對遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 miR-449a對c-Myc、c-Met表達(dá)的靶向抑制作用檢測 采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。將c-Met或c-Myc mRNA的3′-UTR區(qū)克隆至 psicheck-2載體，構(gòu)建psicheck-c-Met-wt及psicheck-c-Myct-wt報(bào)告基因質(zhì)粒；將c-Met或c-Myc mRNA的3′-UTR區(qū)突變后克隆至psicheck-2 載體，構(gòu)建 psicheck-c-Met-mut及psicheck-c-Myct-mut報(bào)告基因質(zhì)粒。取對數(shù)期HEK-293T細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制備成細(xì)胞懸液，按照5×104/孔接種至24孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h。按照操作說明書，采用LipofectamineTM2000將miR-449a、c-Met或c-Myc報(bào)告質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒SV40共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中。培養(yǎng)24 h后按照雙熒光素酶檢測試劑盒操作說明，計(jì)算相對熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 PCO-LECs、normal-LECs中miR-449a及E-cadherin、fibronectin表達(dá)比較 PCO-LECs中miR-449a及E-cadherin、fibronectin蛋白相對表達(dá)量分別為0.34±0.04，0.41±0.03、2.37±0.28；normal-LECs中分別為1.0±0.08、1.0±0.11、1.0±0.10。與normal-LECs比較，PCO-LECs中miR-449a低表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)，fibronectin高表達(dá)(P均<0.05)。

2.2 miR-NC組、mimics組miR-449及E-cadherin、fibronectin表達(dá)比較 miR-NC組、mimics組miR-449a相對表達(dá)量分別為1.00±0.07、1.97±0.16。與miR-NC組比較，mimics組miR-449a表達(dá)高(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)染成功。miR-NC組E-cadherin、fibronectin相對表達(dá)量分別為1.0±0.08、1.0±0.11，mimics組分別為1.9±0.13、0.62±0.04，與miR-NC組比較，mimics組E-cadherin相對表達(dá)量高(P均<0.05)，fibronectin相對表達(dá)量低(P均<0.05)。

2.3 miR-449a對晶狀體上皮細(xì)胞增殖和遷移的影響 miR-NC組細(xì)胞增殖活力(吸光度值)、遷移能力(穿模細(xì)胞數(shù))分別為1.0±0.08、(118±12)個(gè)/視野，mimics組分別為0.36±0.03、(46±3)個(gè)/視野。與miR-NC組比較，mimics組細(xì)胞增殖活力、遷移能力低(P均<0.05)。

2.4 miR-449a對c-Met、c-Myc的靶向抑制作用 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-449a靶向作用于c-Met、c-Myc，miR-449a具有潛在靶向抑制c-Met、c-Myc 3′UTR端的能力。

3 討論

后囊混濁是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，常引起視力丟失。后囊混濁的發(fā)生與術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞遷移、增殖及EMT密切相關(guān)，但關(guān)于整個(gè)后囊混濁發(fā)生的潛在分子機(jī)制尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在后囊混濁的晶狀體上皮細(xì)胞中低表達(dá)，并且證明miR-181a抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、遷移及EMT等過程[4]。因此miRNA在后囊混濁發(fā)病過程中具有重要的作用。同時(shí)，白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞一般在術(shù)后幾小時(shí)內(nèi)開始增殖，并且位于晶狀體表面的上皮細(xì)胞逐漸遷移到無細(xì)胞后囊中，造成后囊混濁。因此抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和遷移對于預(yù)防后囊混濁的發(fā)生具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a在后囊混濁晶狀體上皮細(xì)胞中低表達(dá)，表明miR-449a可能參與疾病發(fā)生過程。因此采用miR-449a mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使miR-449a高表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-449a高表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及遷移。本研究檢測了EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、fibronectin在正常晶狀體上皮細(xì)胞和后囊混濁晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin在后囊混濁晶狀體上皮細(xì)胞中低表達(dá)，但fibronectin高表達(dá)。這表明EMT也與后囊混濁形成密切相關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚未清楚。本研究中通過mimics轉(zhuǎn)染，PCO-LECs細(xì)胞中的miR-449a高表達(dá)，然后檢測細(xì)胞中E-cadherin及fibronectin蛋白表達(dá)，評估m(xù)iR-449a對細(xì)胞EMT過程的影響。結(jié)果miR-449a高表達(dá)組的E-cadherin蛋白表達(dá)升高，fibronectin蛋白表達(dá)降低。表明miR-449a高表達(dá)抑制晶狀體上皮細(xì)胞EMT過程。

根據(jù)以往的研究結(jié)果，晶狀體上皮細(xì)胞常表達(dá)c-Met蛋白，并且其表達(dá)在受到創(chuàng)傷時(shí)顯著提高[8]。另外，c-Met可以激活下游的MAPK及PI3K信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]。因此，c-Met可能通過下游的信號(hào)分子影響晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移和EMT過程，影響后囊混濁發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，c-Myc高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT過程；c-Myc mRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中高表達(dá)[10]；上調(diào)c-Myc表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生[11]。去鐵胺通過調(diào)節(jié)n-Myc下游的基因NDRG1抑制癌細(xì)胞EMT[12]。因此猜測miR-449a可以調(diào)控c-Myc和c-Met的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、遷移以及EMT過程，從而參與晶狀體后囊混濁發(fā)生。

研究表明，miR-449a靶向作用于Flot 2抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和EMT[13]，靶向抑制多個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞的EMT[14]。本研究雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-449a靶向作用于c-Myc和c-Met，抑制二者表達(dá)。

綜上所述，miR-449a過表達(dá)通過靶向抑制c-Myc和c-Met表達(dá)，從而抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖、遷移及EMT,此為后囊混濁的預(yù)防和治療提供了新視角。