miRNAs對肝星狀細胞生物學功能調(diào)控機制的研究進展

梅怡晗，陳星，陳芳，喻雪琴，戢敏，梅小平

(1首都醫(yī)科大學，北京1000069;2川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

肝纖維化(HF)是各種病因所致的慢性肝細胞損傷后持續(xù)發(fā)展的共同病理特征，是肝組織反復創(chuàng)傷與修復的炎性反應以及肝組織細胞外基質(zhì)過度沉積的結(jié)果，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段[1]。肝組織受損后, 在由各種炎性介質(zhì)誘導的多信號轉(zhuǎn)導通路介導下, 處于靜息狀態(tài)的肝星狀細胞(HSC)被激活、增殖, 致肝細胞間基質(zhì)(ECM)大量沉積，是導致肝纖維化、肝硬化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)之一。目前臨床上尚缺乏有效逆轉(zhuǎn)或阻止HF進展的治療藥物。HSC是肝細胞外基質(zhì)的主要來源，是正常肝組織和纖維化肝組織ECM的主要來源。肝組織受損后, 在由各種炎性介質(zhì)誘導的多信號轉(zhuǎn)導通路介導下, 處于靜息狀態(tài)的HSC被激活、增殖, 由靜止型HSC轉(zhuǎn)化為活化型HSC，分泌ECM在肝組織內(nèi)大量沉積，是導致肝纖維化、肝硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2]。深入研究HSC的生物學行為、細胞外調(diào)控機制、信號轉(zhuǎn)導通路、基因組學及免疫學調(diào)控等不同調(diào)控機制，有助于HF的診斷與治療，以抑制HSC激活、增殖及促進HSC凋亡為靶點的治療HF的研究方法已成為目前的研究熱點。微小RNA( miRNA)是一種由19～22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，可與靶miRNAs全部或部分靶向結(jié)合后誘導miRNAs降解或轉(zhuǎn)錄抑制，對轉(zhuǎn)錄后的基因進行調(diào)控[3～6]。部分miRNAs在肝組織內(nèi)表達，在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展、預后和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，miRNAs可通過調(diào)控HSC生物活性功能來發(fā)揮對HF發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控作用。存在于體內(nèi)的miRNA能在轉(zhuǎn)錄與抑制基因表達方面起到重要的調(diào)控作用，特別是對HSC的激活、增殖或凋亡的特異性調(diào)控對肝組織纖維化的發(fā)生起到了重要的調(diào)節(jié)作用，為此可能對肝纖維化的分子靶向治療提供新路徑與理論依據(jù)。現(xiàn)將miRNAs在HSC生物學活性調(diào)控中的作用機制綜述如下，旨在為HF的治療提供新路徑。

1 miRNAs在HSC激活中的作用機制

HSC是一種竇周細胞，位于肝細胞與肝竇內(nèi)皮細胞之間的間隙，即Disse內(nèi)，胞體呈星狀分布的長突，包繞肝細胞與肝血竇[9]。正常肝組織中HSC主要以富含VitA脂滴的靜止型細胞存在，其增殖活性與膠原纖維合成能力均較低。其生理功能包括：ECM的合成與降解；細胞因子及受體的表達；肝竇血流量的調(diào)節(jié)等[10]。

HSC的激活是指在各種致炎因子作用下，將靜息的、富含維生素A的細胞活化為致纖維化的肌成纖維化細胞，誘發(fā)并獲得收縮纖維以及細胞增殖[11]。活化的HSC大量增殖后導致以膠原纖維為主的ECM分泌增多，并高表達具有收縮功能的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)水平，α-SMA的表達是HSC激活與活化的標志。HSC的活化包括HSC的活化啟動與持續(xù)兩個階段。啟動階段是指基因表達與表型改變，使靶細胞對刺激因子發(fā)生反應的過程。持續(xù)階段是這些刺激所產(chǎn)生的反應不斷維持活化表型與促進纖維化的效應[12]。慢性肝病或肝組織纖維化過程中靜止型HSC可轉(zhuǎn)化為活化型HSC。活化型HSC參與并調(diào)節(jié)維生素A的代謝，為肝細胞儲存能量；誘導機體產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶抑制物(TIMP)，參與肝組織ECM生成、降解或膠原纖維產(chǎn)生[13]，導致肝纖維化的形成。

HSC的激活與否是肝組織發(fā)生纖維化的中心環(huán)節(jié)。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，目前有17個miRNAs在高表達時可促進HSC的激活，同時有14個miRNAs在低表達時可促進HSC的激活。Venugopal 等[15]研究結(jié)果顯示，miR-150、miR-194在激活的HSC 中低表達，表明miR-150、miR-194可抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子c-myb和rac-1表達，抑制HSC的激活，進一步降低ECM 的表達。Li 等[16]研究結(jié)果顯示，HF模型大鼠活化型HSC中miR-34a/c高表達，而低表達的miR-34a /c能使活化型HSC轉(zhuǎn)化為靜息型HSC，miR-34a /c可能與抑制其靶基因過氧化物酶體增殖物激活受體α相關(guān)。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝纖維化模型活化HSC中miR-122、miRNA -150均呈低表達，這可能與miR-122、miRNA -150可抑制c-myb和rac1表達，進而抑制HSC活化；本研究同時發(fā)現(xiàn)，活化HSC中存在miR-221 、miR-222高表達，其高表達可能調(diào)控了HSC 激活的相關(guān)基因表達，誘導了HF的發(fā)生。促進miR-122和miRNA -150表達或抑制miR-221 、miR-222表達可抑制肝組織纖維化的發(fā)生發(fā)展。在體外細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，miR-221 、miR-222能促進HSC中Ⅰ型膠原的表達，進一步猜測miR-222可能激活NF-κB信號通路，來調(diào)控炎癥反應。

TGF-β/Smad、p38MAPK、Wnt/β-catenin和P13K/Akt 等是調(diào)控肝組織纖維化發(fā)生發(fā)展的主要信號通路。其中TGF-β是參與HSC激活、增殖與凋亡作用的最主要的細胞因子之一，是調(diào)控肝組織纖維化發(fā)生的最主要的信號通路。TGF-β/Smad可抑制HSC的增殖與活化，導致ECM在肝細胞間的過度沉積而發(fā)生肝纖維化。HSC中miR-200高表達時可抑制其靶基因Keap1的表達，促進Nrf2的核遷移與激活，抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，進而阻斷肝纖維化的發(fā)生[17]；miR-200a高表達可抑制TGF-β對HSC的活化、增殖，降低Smad4的表達；抑制HF。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-33a對 PI3K/Akt 信號通路的活化具有調(diào)控作用，調(diào)控miR-33a的表達水平對PI3K/Akt 信號通路具有明顯的調(diào)節(jié)作用。miR-214對PI3K/Akt信號通路具有明顯的負性調(diào)節(jié)作用，進而誘導、促進了肝纖維化的發(fā)生。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt /β-catenin信號通路是miR-200a的下游靶基因和信號通路，miR-200a可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路來對肝纖維化發(fā)生的抑制作用，延緩或阻止肝纖維化進程。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是激活HSC的最強細胞因子，它可通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路來激活HSC。研究[19]發(fā)現(xiàn)，miR-19b可通過靶向調(diào)控TGF-β1RⅡ/Smad3 的表達水平來降低Ⅰ、Ⅱ等前膠原的表達，進而調(diào)控肝組織纖維化的發(fā)生與發(fā)展。miRNAs通過調(diào)控細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶-1(Raf/ERK1)、肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)、第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白/肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶(PTEN/PI3K/AKT)等信號轉(zhuǎn)導通路，促進HSC的激活。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b通過與PI3KR1/AKT3的3′-UTR的結(jié)合來發(fā)揮抑制HSC的激活。Wei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21高表達可激活HSC，miR-21m低表達可通過降低PTEN蛋白表達水平來抑制HSC的激活。對PI3K具有抑制作用的LY294002可抑制AKT信號通路的活化，抑制HSC的活化，進而抑制肝組織纖維化的發(fā)生。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過對SPRY2和HNF4α的3，-UTR的直接靶向作用來發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，導致EKI1信號通路的激活，進而誘導HSC的激活來促進肝組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

2 miRNAs在HSC增殖中的作用機制

有學者[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19b、miR-150、miR-194、miR-146a、miR-29等可抑制HSC的增殖, 特別是miR-200a的失衡與肝組織纖維化中ECM的異常表達密切相關(guān)。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)，用CCl4誘導大鼠發(fā)生肝組織纖維化，大鼠肝組織miR-200a呈低表達；HSC的增殖率明顯升高，上調(diào)miR-200a的表達可降低TGF-β2的表達, 抑制TGF-β和Wnt/β-catenin信號通路的激活, 抑制HSC的增殖，發(fā)揮抗纖維化的作用；miR-200a可通過靶向調(diào)控胞質(zhì)蛋白伴侶分子/核因子E2相關(guān)因子(Keap1 /Nrf2)信號通路來抑制HSC增殖。He等[24]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)誘導的HSC活化、增殖過程中存在miR-146表達降低；轉(zhuǎn)染miR-146至激活的HSC中會抑制HSC的增殖。Sekiya 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)大鼠HSC的增殖過程中存在miR-195低表達，進一步分析認為miR-195能延遲HSC的G1期向S期發(fā)育來抑制HSC的增殖。miR-17-5p 可通過靶向調(diào)控Smad7來促進HSC的增殖而誘導肝組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展[26]。

TGF-β1及相關(guān)膜受體結(jié)合并活化后，可招募、活化相同受體的下游Smad家族蛋白，miRNAs可通過對TGF-β1/Smad信號通路的調(diào)控，促進HSC增殖。在大鼠肝HSC自發(fā)活化過程中，HF組織中miR-9表達升高，且其表達水平與肝組織纖維化程度呈正相關(guān)，HF組織中miR-150表達降低，提示miR-150可抑制HSC的增殖。

研究[27～29]發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導活化的HSC中miR-17表達升高，靶向調(diào)控Smad7表達，進而誘導、促進HSC增殖。相反，TGF-β1誘導活化的HSC中miR-146表達降低，抑制miR-146表后活化型HSC數(shù)量減少，HSC的增殖能力與數(shù)量下降，α-SMA表達降低，表明miR-146、miR-17表達變化可通過影響Smad7表達調(diào)控HSC的增殖。

3 miRNAs在HSC凋亡中的作用機制

促進HF的發(fā)生與逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵在于促進HSC凋亡，HSC大量凋亡后活化的HSC數(shù)量顯著降低，ECM分泌減少，HF可自發(fā)性逆轉(zhuǎn)。王慧利等[27,30]研究發(fā)現(xiàn)，將miR-15b、miR-16轉(zhuǎn)染到活化的HSC后發(fā)現(xiàn)，線粒體相關(guān)抗凋亡蛋白(Bcl-2)表達減少，miR-15b、miR-16 可降低Bcl-2的表達，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，促進HSC的凋亡；進一步將PLV-miR-16轉(zhuǎn)染到活化型HSC后發(fā)現(xiàn)，細胞的代謝周期發(fā)生紊亂并受到抑制，細胞凋亡增加，并發(fā)現(xiàn)miR-16能降低細胞周期蛋白D1的表達，從而抑制細胞增殖，促進激活后的HSC凋亡。Sekiya等[25]研究結(jié)果顯示，miR-195高表達可促進其與細胞周期蛋白3′-UTR的結(jié)合，抑制細胞周期 G1/S期轉(zhuǎn)化，從而抑制HSC的活化與增殖，促進HSC的凋亡。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29能使細胞周期蛋白D1和p21cip1的表達水平下調(diào)，阻滯HSC的代謝周期G1期向S期發(fā)育，誘導Caspase和PARP凋亡基因水平高表達，促進HSC凋亡。miR-21可通過抑制其靶基因PTEN的表達，抑制HSC的活化，促進HSC的凋亡，抑制ECM的產(chǎn)生與沉積[19]。

HSC活化過程中共10種miRNAs表達升高，9種miRNAs表達降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，促纖維化細胞因子血小板衍生生長因子BB可誘導促進miR-21表達，抑制靶基因PTEN表達，誘導AKT 激酶活化，促進HSC由靜止型轉(zhuǎn)化為活化型。miR-15b、miR-16表達改變可通過抑制Bcl-2表達，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9來誘導、促進HSC凋亡。miR-21是HSC的調(diào)控機制中PTEN信號通路的靶基因，對AKT 激酶發(fā)揮抑制作用，能抑制HSC活化、誘導HSC凋亡。

綜上所述，miRNAs通過調(diào)控HSC的活化、增殖以及凋亡，參與HF的發(fā)生發(fā)展。miRNAs可直接或通過TGF-β1/Smad、Raf/ERK1、PI3K/AKT、JAK/STAT、PTEN/PI3K/AKT等信號轉(zhuǎn)導通路促進HSC的激活。miR-19b、miR-150、miR-194、miR-146a、miR-29等可抑制HSC的增殖。miR-9、miR-150、miR-146、miR-17等可通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路，調(diào)控HSC的增殖。miRNAs可抑制Bcl-2、細胞周期蛋白D1表達，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，促進HSC凋亡。