EGFR基因敏感突變晚期非小細(xì)胞肺癌患者血清c-MET基因表達(dá)變化及其意義

李麗娜，徐瑞，王玉珍，陳琳

(1陜西省腫瘤醫(yī)院，西安710061；2 陜西省人民醫(yī)院)

近年來(lái)，分子靶向治療在具有驅(qū)動(dòng)基因的晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的治療中取得顯著療效，其中最具代表性的是針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的靶向治療。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是一種小分子EGFR抑制劑，可通過(guò)內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR，抑制酪氨酸激酶的活化，阻斷EGFR信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)效應(yīng)。因此，EGFR-TKI類藥物是目前EGFR基因敏感突變晚期NSCLC的主要治療方法。臨床最常用的EGFR-TKI藥物為吉非替尼(Gefitinib)，但患者易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，且部分患者緩解期較短。約50%的繼發(fā)耐藥由EGFR20外顯子的T790M突變所致，T790M突變可改變EGFR空間構(gòu)象，使EGFR-TKIs與EGFR結(jié)合受阻，從而導(dǎo)致耐藥；另外約20%的獲得性耐藥與間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子受體(c-MET)的擴(kuò)增有關(guān)，c-MET通過(guò)癌基因ErbB3繞過(guò)gefitinib作用靶點(diǎn)，介導(dǎo)PI3K通路持續(xù)激活，導(dǎo)致獲得性耐藥[1，2]。本研究檢測(cè)了50例EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者血清c-MET基因表達(dá)，分析其與NSCLC患者臨床病理參數(shù)關(guān)系以及與TKI治療療效的相關(guān)性，旨在為血清c-MET預(yù)測(cè)EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者臨EGFR-TKI治療的效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2017年4月間在陜西省腫瘤醫(yī)院接受吉非替尼單藥一線治療的EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者50例，其中男22例、女28例，<60歲23例、≥60歲27例；吸煙者21例，不吸煙者29例；腫瘤分化程度為高、中分化20例、低分化30例；腺癌43例(含3例細(xì)支氣管肺泡癌)、鱗癌7例；按照ECOG一般身體狀況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為PS 0～1分者22例；均符合UICC第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，影像學(xué)檢查初步診斷為肺癌Ⅳ期；均為首次來(lái)我院確診，未接受過(guò)任何抗腫瘤治療；無(wú)手術(shù)指征。50例患者均穿刺活檢取腫瘤組織進(jìn)行EGFR基因18～21號(hào)外顯子突變檢測(cè)，均為19DEL或L858R突變者，確定為EGFR基因敏感突變。根據(jù)RESIST1.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，至少有一個(gè)可評(píng)價(jià)測(cè)量病灶，預(yù)計(jì)生存時(shí)間>12周。治療期間患者僅可接受骨轉(zhuǎn)移止痛治療和其它對(duì)癥處理外，不接受其他抗腫瘤治療和生物治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者或家屬在入組前均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Pfu PCR MasterMix(天根科技生化有限公司)；E.Z.N.A.?Blood DNA Kit(美國(guó) Omega 公司)；瓊脂糖(西班牙 Biowes 公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha innotech 公司)

1.3 血清c-MET基因表達(dá)檢測(cè) 50例患者均于吉非替尼治療前采集空腹外周靜脈血3 mL，室溫靜置6 h，3 000 r/min離心 10 min，取上清，-70 ℃保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)血清c-MET表達(dá)，提取血清DNA， 紫外分光光度儀測(cè)定DNA的OD260和OD280，OD260/OD280值在1.7～2.0為提取DNA合格。合成PCR引物c-MET基因上游引物：5′-TCACATCTCTCACCTCATCTG-3′，下游引物：5′-GAAGGCAGGCATTTCTGTA-3′；內(nèi)參基因Line-1上游引物：5′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3′，下游引物：5′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′。退火溫度60 ℃。以上引物均由大連寶生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為20 μL：PCR Mix 10 μL，上游引物(10 μM) 0.5 μL，下游引物(10 μM) 0.5 μL，模板DNA 2 μL，去離子水 7 μL。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性1 min，40個(gè)循環(huán)，95 ℃10 s；60 ℃30 s。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔以減少實(shí)驗(yàn)誤差。試劑盒購(gòu)買自西安化學(xué)試劑廠。以2-△△Ct代表c-MET的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 吉非替尼治療及預(yù)后方法 50例患者于首日晚上服用吉非替尼(Iressa,阿斯利康公司產(chǎn)品)250 mg，以后每日早晨空腹服用吉非替尼 250 mg，直至疾病進(jìn)展或出現(xiàn)無(wú)法耐受的不良反應(yīng)。治療后觀察并記錄進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)、總生存時(shí)間(OS)。PFS定義為首次服用吉非替尼至有客觀證據(jù)證明疾病進(jìn)展或任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。OS定義為從服用吉非替尼開(kāi)始至任何原因死亡的時(shí)間。主要研究終點(diǎn)為0S和PFS。截止研究終點(diǎn)仍未進(jìn)展或死亡患者以最后一次隨訪評(píng)價(jià)時(shí)間作為截尾數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

50例患者血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量為0.046 1±0.011，<60歲、≥60歲者血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.059±0.013、0.043±0.021；男、女性血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.042±0.025、0.056±0.018；吸煙、不吸煙者血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.048±0.016、0.053±0.029；腺癌、鱗癌血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.047±0.019、0.052±0.025；高中分化、低分化者血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.055±0.014、0.052±0.023；血清c-MET表達(dá)與EGFR敏感突變NSCLC患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤類型、分化情況間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為0.283、-0.835、0.748、0.917、1.063；P均>0.05)。

50例患者血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為0.050，以0.050為界限將50例患者分為c-MET高表達(dá)組24例、低表達(dá)組26例，血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.062±0.014、0.031±0.015，二者比較，P<0.05。

50例患者的PFS、OS分別為11.2、23.4個(gè)月，c-MET基因高、低表達(dá)組PFS分別為8.5、13.9個(gè)月；OS分別為22.9、24.3個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線顯示，血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量與EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者吉非替尼治療后PFS有關(guān)(χ2=3.989，P<0.05)，與患者OS無(wú)關(guān)(χ2=0.712，P>0.05)。

Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量是EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者非EGFR-TKI治療的獨(dú)立不良預(yù)后因素(P<0.05)。

3 討論

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和病死率絕對(duì)數(shù)最高的惡性腫瘤，其中85%以上為NSCLC[3～7]。EGFR-TKIs使NSCLC的治療從細(xì)胞毒藥物廣譜治療模式進(jìn)入個(gè)體化、靶向治療模式[8，9]。EGFR-TKI治療肺癌的療效與EGFR突變密切相關(guān)。EGFR突變位點(diǎn)主要為18～21外顯子，最常見(jiàn)的為19外顯子的缺失突變(導(dǎo)致delE746-A750氨基酸殘基片段缺失)和21外顯子的點(diǎn)突變(L858R氨基酸殘基的置換)。EGFR突變可增強(qiáng)NSCLC患者對(duì)EGFR-TKI的敏感性。EGFR-TKI是目前EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者的一線治療方案。但EGFR基因敏感性突變的NSCLC患者在服用EGFR-TKI治療8～10個(gè)月后也會(huì)發(fā)生獲得性耐藥，且部分患者緩解期非常短。因此耐藥基因的檢測(cè)對(duì)治療模式的選擇及臨床預(yù)后判斷尤為重要。

c-MET由MET原癌基因編碼，是一類具有自主磷酸化活性的跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體超家族，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是目前發(fā)現(xiàn)其唯一配體。當(dāng)c-MET與HGF結(jié)合后，酪氨酸殘基可出現(xiàn)自身磷酸化，酪氨酸激酶被激活，c-MET梭基末端酪氨酸發(fā)生磷酸化，激活下游RAS-MAPK /ERK、PI3K-PKB /AKT等信號(hào)通路，參與誘導(dǎo)多種上皮細(xì)胞有絲分裂、增加細(xì)胞存活時(shí)間、增強(qiáng)細(xì)胞遷移及向胞外基質(zhì)侵襲能力、促進(jìn)腺管狀形態(tài)發(fā)生，在胚胎發(fā)育、上皮生長(zhǎng)、組織分化、損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10，11]。c-MET參與調(diào)控多個(gè)生物學(xué)功能，包括增殖和侵襲，當(dāng)失調(diào)的c-MET異常激活，可以導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。許多惡性腫瘤都伴有c-MET基因的擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)[12]。c-MET基因突變、擴(kuò)增、c-MET蛋白過(guò)表達(dá)在NSCLC的發(fā)生發(fā)展及EGFR-TKI耐藥性方面發(fā)揮重要作[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，具有EGFR19外顯子缺失突變的HCC827 細(xì)胞株對(duì)吉非替尼敏感，但長(zhǎng)時(shí)間吉非替尼誘導(dǎo)后，HCC827細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥，檢測(cè)c-MET 基因拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增5～10倍；進(jìn)一步研究證明 c-MET 的基因擴(kuò)增激活了c-MET/ ERBB3/PI3K信號(hào)通路，從而引起非小細(xì)胞肺癌對(duì)吉非替尼耐藥。Noonan等[15]通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)了447例NSCLC患者的腫瘤組織中EGFR、c-MET基因表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，435例進(jìn)行c-MET基因檢測(cè)的患者中48例出現(xiàn)基因拷貝增高(≥5拷貝/細(xì)胞)，其中18例為真性c-MET基因擴(kuò)增，c-MET基因擴(kuò)增陽(yáng)性患者較陰性患者生存期短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，c-MET基因擴(kuò)增是術(shù)后NSCLC患者的獨(dú)立不良預(yù)后因素。c-MET 擴(kuò)增作為除EGFR突變之外的另一種NSCLC 驅(qū)動(dòng)基因，是體現(xiàn)不良預(yù)后的因子，同時(shí)也是EGFR-TKI 治療繼發(fā)耐藥基因之一。研究[16]報(bào)道，在c-MET擴(kuò)增的耐藥肺癌細(xì)胞中，c-MET抑制劑可明顯提高EGFR TKI耐藥肺癌細(xì)胞的敏感性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量與NSCLC性別、年齡、吸煙史、病理類型等臨床病理特點(diǎn)均無(wú)關(guān)。生存分析顯示，治療前血清c-MET基因相對(duì)表達(dá)量情況與EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療后PFS有關(guān)，但與OS無(wú)關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清c-MET基因表達(dá)是晚期NSCLC EGFR-TKI治療的獨(dú)立不良預(yù)后因素。并說(shuō)明血清c-MET參與了EGFR-TKI的獲得性耐藥，檢測(cè)EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療前血清c-MET基因的擴(kuò)增情況可預(yù)測(cè)EGFR-TKI療效。

綜上所述, EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者治療前血清c-MET基因表達(dá)水平與吉非替尼治療后PFS有關(guān)。血清c-MET基因表達(dá)可能成為EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療療效的預(yù)測(cè)因素。