丁酸梭菌的研究與應(yīng)用

唐 昊，韓奇鵬，張佩華

（ 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）

1933年日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌，又被稱為宮入菌、酪酸菌、丁酸梭狀芽孢桿菌和酪酸梭菌，是梭菌屬、芽孢桿菌科嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性厭氧細(xì)菌，可產(chǎn)生一種丁酸，并在培養(yǎng)過濾物中含有少量脂肪酸[1]。具有抑制沙門氏菌、大腸桿菌等致病菌和促進(jìn)腸道乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌生長的整腸作用。

1 丁酸梭菌特征

丁酸梭菌常被發(fā)現(xiàn)于健康動(dòng)物糞便、土壤、自然酸奶和干酪中[2]。菌體一般單個(gè)或成對存在，體呈稍彎曲或直桿狀，寬0.6～1.2 μm，長3.0～7.0 μm，兩段鈍圓；芽孢呈橢圓形或圓形，孢子呈次端生或偏心，無孢附屬絲和外壁，細(xì)胞壁含D、L-二氨基庚二酸和葡萄糖，周身鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，偶見絲狀菌體。菌落表面形態(tài)直徑1～3 mm，呈稍不規(guī)則的圓形，菌落成奶油色或白色。丁酸梭菌能夠促進(jìn)多種碳水化合物發(fā)酵生成乙酸、丁酸、淀粉酶、丁醇、維生素和脂肪酶等，并產(chǎn)生大量氫氣，菌株廣泛用于產(chǎn)氫能源領(lǐng)域。最適生長繁殖溫度為25～37℃，可合成自身生長所需的維生素和氨基酸[3]。

2 丁酸梭菌生理功能

2.1 營養(yǎng)作用

丁酸梭菌可產(chǎn)生良好的動(dòng)物所需的營養(yǎng)素來源或具有輔助消化作用的丁酸、消化酶、氨基酸、B族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。丁酸梭菌產(chǎn)生輔助動(dòng)物消化飼料日糧的胞外酶主要有蛋白酶和淀粉酶等，并分泌大量的胞內(nèi)酶。同時(shí)，丁酸梭菌和拜仁梭菌混合可產(chǎn)生果膠裂解酶和果膠甲酯酶，在腸道產(chǎn)生的果膠最終分解為SCFA[4]。丁酸梭菌代謝中產(chǎn)生的VB1、VB2、泛酸和煙酸等，為動(dòng)物代謝和生長發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，像維生素K和B族維生素不但可以提供營養(yǎng)，還可促進(jìn)維生素E的吸收。研究表明，丁酸梭菌在37℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，上清液中葉酸濃度可以達(dá)到8.0 mmol·L-1，維生素B12含量為93 pg·mL-1和維生素B2含量可達(dá)111.0 ng·mL-1[5]。

2.2 維持腸道菌群平衡

作為調(diào)整腸道功能的代表性菌之一的丁酸梭菌，具有促進(jìn)有益菌定植和繁殖及抑制有害菌生長的特點(diǎn)。丁酸梭菌產(chǎn)生的脂肪酸（乙酸、丁酸）有降低腸道內(nèi)pH，抑制有害菌附著與繁殖的功能。

有研究將丁酸梭菌分別按不同比例體外混合培養(yǎng)于有益菌雙歧桿菌、乳酸桿菌和有害菌雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌中，結(jié)果表明，丁酸梭菌可增強(qiáng)雙歧桿菌和乳酸桿菌的繁殖，并一定程度抑制雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌[6]。

同時(shí)，張達(dá)榮等采用丁酸梭菌制劑服用于有腹瀉、便秘癥狀的患者，結(jié)果表明，丁酸梭菌可促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖，并抑制腸道內(nèi)病原菌和腐敗菌[7]。

丁酸梭菌調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境的可能機(jī)制總結(jié)為4點(diǎn)。丁酸梭菌在動(dòng)物腸道內(nèi)有競爭營養(yǎng)物質(zhì)的作用，一定程度抑制有害菌的生長繁殖，并占據(jù)腸上皮細(xì)胞黏附位點(diǎn)，進(jìn)而抑制致病微生物黏附生長；丁酸梭菌可分泌分解多聚糖的多糖分解酶，促使腸道有益菌的發(fā)酵底物增多，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體生長、繁殖；短鏈脂肪酸（SCFA）的大量產(chǎn)生，可促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)、腸道pH降低及抑制有害菌生長，并分泌細(xì)菌素可以抑制致病菌蛋白質(zhì)和核酸的合成、降低ATP濃度，促使細(xì)胞內(nèi)K+外流，進(jìn)而抑制有害菌定植生長；丁酸梭菌可促使細(xì)胞壁上的脂磷壁酸可抑制大腸桿菌在腸上皮細(xì)胞的黏附作用[8-12]。

2.3 促進(jìn)生長

丁酸梭菌生長過程中能分泌蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、纖維素酶和糖苷酶等多種酶類。研究表明，高產(chǎn)淀粉酶的丁酸梭菌菌株可以在雞表面粘液中分離得到[8]。分離純化定植在動(dòng)物腸道內(nèi)的丁酸梭菌可產(chǎn)生果膠甲酯酶和魔芋葡甘露聚糖降解酶[13]。而產(chǎn)維生素酶的丁酸梭菌菌株可在土壤腐木和動(dòng)物糞便的混合物中篩選分離出來[14]。丁酸梭菌產(chǎn)生酶類有助機(jī)體對碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體生長。丁酸梭菌飼喂1日齡羅斯肉雞42 d，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌比抗生素更能明顯提高肉雞重量[15]。此外，丁酸梭菌代謝產(chǎn)物丁酸等能修復(fù)腸道及促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞再生，其合成的各種維生素能維持人體健康。

2.4 免疫功能及抗氧化性

丁酸梭菌可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，促使機(jī)體免疫力增強(qiáng)，進(jìn)而維持動(dòng)物健康。丁酸梭菌的抗炎作用主要是通過激活動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的TLR-2，從而調(diào)節(jié)NF-κB信號途徑分泌促炎因子（TNF-α、IL-6），進(jìn)而降低機(jī)體致病菌的感染。丁酸梭菌喂給肉雞后，肉雞血清總蛋白和免疫球蛋白IgM含量都顯著提升[15]。同時(shí)，丁酸梭菌飼喂仔公雞，可使仔公雞的免疫球蛋白含量、IgG蛋白含量、間胸腺指、脾臟指數(shù)和血清補(bǔ)體3含量均有一定程度的增加[16]。此外，無菌小鼠口服丁酸梭菌后發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)IgA蛋白含量升高，但丁酸梭菌滅活后飼喂小鼠，腸道內(nèi)IgA蛋白含量沒有增加，進(jìn)一步試驗(yàn)表明丁酸梭菌可以使小鼠體內(nèi)多細(xì)胞黏膜免疫系統(tǒng)激活[17]。

研究表明，丁酸梭菌滅活后，可激活小鼠巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，且通過誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的IFN-γ，進(jìn)而提高小鼠機(jī)體免疫功能[18]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可促進(jìn)無菌小鼠的腸道免疫和增強(qiáng)抗霍亂毒素的活性[17]。丁酸梭菌可介導(dǎo)體液免疫途徑，促使鲇魚血清和皮膚的溶解酶活性和免疫球蛋白水平增強(qiáng)及血清酚氧化酶和酸性磷酸酶活性[19]。此外，雙糞腸球菌可與丁酸梭菌聯(lián)合使用，增加腹瀉兒童的血清抑炎因子IL-10含量，降低促炎因子TNF-α水平[20]。

2.5 抗腫瘤和抗癌

丁酸梭菌對抗腫瘤和抗癌有一定效果。首次發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌M55具有溶癌活性是在20世紀(jì)50年代，并在20世紀(jì)70年代得到證實(shí)[21]。研究表明，丁酸梭菌代謝產(chǎn)物丁酸可抑制人體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞及促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞調(diào)亡[22-23]。研究表明，丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)生的上清液可降低結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞的增殖，提高其調(diào)亡率，并使其調(diào)亡周期阻滯與G0/G1期[24]。丁酸梭菌液體灌入H22肝癌小鼠胃部后發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可抑制肝癌細(xì)胞增殖[25]。丁酸梭菌產(chǎn)生的胞外多聚糖對肉瘤起到完全抑制作用[26]。由于丁酸梭菌分泌的激肽酶具有分解激肽的作用，可對癌組織的毛細(xì)血管微循環(huán)造成一定的破壞，進(jìn)而促使癌組織壞死，丁酸梭菌分泌丁酸可為腸上皮細(xì)胞提供能量和減少腸道致癌物質(zhì)（亞硝酸胺）的致癌活性。

研究表明，益生菌可以用來預(yù)防腫瘤，是治療腫瘤的一種潛在方法，但沒有實(shí)例證明。丁酸梭菌可在腫瘤組織中選擇性的定植，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[27]。丁酸梭菌既可減少腸道致癌物質(zhì)的活性和溶癌的作用，還可以作為腫瘤基因治療載體。為更加有效、精準(zhǔn)的治療腫瘤，可把TNF-α和胞嘧啶氨酶等基因轉(zhuǎn)入丁酸梭菌中，讓其在腫瘤細(xì)胞中選擇性定植[28]。

3 丁酸梭菌培養(yǎng)工藝

3.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)

固體發(fā)酵與液體發(fā)酵相比較而言，具有產(chǎn)品分離難、生長難控制、方法不成熟等缺點(diǎn)。但固體發(fā)酵投資少、設(shè)備與操作簡單及其發(fā)酵來源廣泛（農(nóng)副產(chǎn)品、淀粉質(zhì)原料、食品工業(yè)下腳料等）和發(fā)酵產(chǎn)品益于長時(shí)間貯藏運(yùn)輸。研究表明，以豆粕為培養(yǎng)基質(zhì)，接種14%，30℃發(fā)酵72 h后，菌體濃度可達(dá)1.08×108cfu·mL-1[29]。此外，麥麩∶豆粕=1∶1優(yōu)化組合，CaCl2為0.2%，接種72%，37℃發(fā)酵72 h，菌體濃度可達(dá)2.2×108cfu·mL-1[30]。

3.2 液體深層發(fā)酵

目前經(jīng)常采用的丁酸梭菌發(fā)酵方法是液體深層發(fā)酵法，此法便于控制氧氣含量，因?yàn)槎∷崴缶鷮儆趨捬蹙?yōu)化培養(yǎng)基的成分多采用響應(yīng)面法或正交試驗(yàn)。研究表明，為使菌體濃度達(dá)到8×108cfu·mL-1，可采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分（大豆粉20 g·L-1，葡萄糖8.0 g·L-1，啤酒酵母提取物5.0 g·L-1）[31]。同樣采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化丁酸梭菌最佳培養(yǎng)基組成，使菌體濃度達(dá)到4.1×108cfu·mL-1（葡萄糖8.0 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母膏4.0 g·L-1），芽孢轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%（上述基礎(chǔ)上添加MnSO4·H2O 0.2 g·L-1、K2HPO45 g·L-1、CaCO31 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1）[32]。為使菌體濃度高達(dá)10×108cfu·mL-1，利用響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌培養(yǎng)基（果膠 5 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、大豆提取物 39.8 g·L-1、酪蛋白 2.0 g·L-1、玉米粉 3.7 g·L-1，NaHCO31.24 g·L-1、（NH4）2SO41.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、MnSO4·H2O 0.2 g·L-1、CaCL20.02 g·L-1[33]。菌體濃度為3×108cfu·mL-1時(shí)，采用清液發(fā)酵策略，丁酸梭菌優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基組分（牛肉浸膏15 g·L-1、胰蛋白胨40 g·L-1、葡萄糖34 g·L-1、可溶性淀粉1.0 g·L-1、乙酸鈉3.0 g·L-1、NaCl 5.0 g·L-1、初始pH=7.0、酵母浸粉38 g·L-1、（NH4）2SO41.0 g·L-1、半胱氨酸 0.5 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1[34]。為得到10×108cfu·mL-1芽孢數(shù)，通過響應(yīng)法和PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基（酵母粉6.0 g·L-1、面粉 37.2 g·L-1、米粉 39.6 g·L-1、魚粉 9.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 19 g·L-1、NaCl 1.9 g·L-1、CaCO34.8 g·L-1、NaHCO30.1 g·L-1、KH2PO40.1 g·L-1）[35]。

4 丁酸梭菌的研究與應(yīng)用

目前丁酸梭菌主要被應(yīng)用于體內(nèi)正常菌群失衡導(dǎo)致的相關(guān)疾病治療，如臨床治療感染性腹瀉、炎癥性腸病、腸易激綜合征等，還應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)過程中。

4.1 臨床研究與應(yīng)用

丁酸梭菌可以顯著治療腹瀉、炎癥、便秘等疾病，且有極強(qiáng)的整腸作用。研究表明，酪酸梭菌二聯(lián)活菌散可顯著降低嬰兒腹瀉的發(fā)病率[36]。同時(shí)，酪酸梭菌二聯(lián)活菌散可有效治愈潰瘍性結(jié)腸炎[37]。最先將酪酸菌相關(guān)制劑投入商業(yè)化臨床應(yīng)用的國家是日本，現(xiàn)已形成多種產(chǎn)品。我國對丁酸梭菌微生態(tài)制劑的研究起步較晚，目前國內(nèi)較常用的酪酸梭菌相關(guān)產(chǎn)品包括酪酸梭菌二聯(lián)活菌散、酪酸梭菌活菌膠囊、口服酪酸梭菌、活菌片和口服酪酸梭菌等。

4.2 丁酸梭菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的研究與應(yīng)用

4.2.1 增強(qiáng)機(jī)體免疫力

在幼齡畜禽的日糧中添加丁酸梭菌可有效提高動(dòng)物機(jī)體免疫功能。研究表明，丁酸梭菌（2×107cfu·kg-1）添加到肉仔雞的日糧中，可使肉仔雞血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量顯著增加（P＜0.05）[38]。同時(shí)，丁酸梭菌對K88大腸桿菌攻毒引起的肉雞生長性能下降有一定緩解作用，并促進(jìn)攻毒后肉雞血清IgM、IgA含量和黏膜sIgA含量增加，進(jìn)而提高機(jī)體免疫能力[39]。

在畜牧業(yè)中丁酸梭菌主要應(yīng)用于飼料添加劑和獸藥，可有效提高動(dòng)物機(jī)體抗病原微生物的能力。研究表明，仔雞服用乳酸菌、酵母菌和酪酸菌復(fù)合酪酸菌制劑，結(jié)果表明，可以預(yù)防大腸桿菌感染（97.5%）、降低大腸桿菌引起的死亡（50%），增加仔雞體重（8.28%）[40]。以美國紅魚為研究對象，飼喂丁酸梭菌菌粉飼料（1.0×109cfu·g-1），結(jié)果表明，丁酸梭菌可顯著提高美國紅魚體表粘液溶菌酶活性和血清中補(bǔ)體C3水平及吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性[41]。

丁酸梭菌可抑制腸道腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，增加腸內(nèi)短鏈脂肪酸的生成量，促進(jìn)動(dòng)物排便，且抑制有害菌生長，進(jìn)而在治療腸道疾病中得到廣泛應(yīng)用。

4.2.2 提高動(dòng)物生長性能

動(dòng)物機(jī)體的消化吸收功能與腸道隱窩深度和絨毛高度密切相關(guān)，丁酸梭菌可改善動(dòng)物腸道健康，進(jìn)而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。研究表明，丁酸梭菌（108cfu·kg-1）可有效提高仔豬平均日增重，降低料重比，降低隱窩深度，增加小腸絨毛長度，進(jìn)而提高仔豬的消化能力[42]。109cfu·kg-1丁酸梭菌可增加鯰魚生產(chǎn)性能和降低飼料轉(zhuǎn)化系數(shù)[19]。丁酸梭菌還可提高1～24日齡肉雞平均日增重和日采食量[43]。此外，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍的復(fù)合益生菌可有效提高生長育肥豬的表觀消化率和日增重，降低料肉比[44]。

4.2.3 提高動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)

丁酸梭菌除了能促進(jìn)動(dòng)物生長外，還可以促進(jìn)腸道微生物區(qū)系穩(wěn)定，對相關(guān)疾病有一定的治療效果，還可減少動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留。研究表明，肉雞飼料日糧中添加丁酸梭菌（109cfu·kg-1）和枯草芽孢桿菌（1010cfu·kg-1）的復(fù)合益生菌2%，可有效降低肉雞血清中甘油三酯和膽固醇的含量及胸肌亮度，增加肌肉的感官品質(zhì)[45]。

同類復(fù)合益生菌還對生長育肥豬的大理石紋評分、肉色評分和肌肉紅度有一定的提高作用[44]。此外，單獨(dú)添加丁酸梭菌可顯著增加肉雞腿肌和胸肌的肌內(nèi)脂肪含量及腿肌的肌纖維直徑，還可減少動(dòng)物脂肪沉積?？赡苁怯捎诙∷崴缶拇x產(chǎn)物和細(xì)胞壁成分對動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的血管生成素樣蛋白4表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用。并對脂蛋白脂肪酶活性起到抑制作用，進(jìn)而阻止甘油三酯的沉積[43]。

5 小結(jié)

丁酸梭菌的理化性質(zhì)具有抵抗外界惡劣環(huán)境的作用。體內(nèi)受消化液、胃酸和膽汁酸影響較小，且對抗生素敏感性較弱[46]。因此丁酸梭菌廣泛應(yīng)用于微生態(tài)制劑。此外，丁酸梭菌在飼料添加劑、食品添加劑、人腸炎治療藥物和獸藥中有著廣泛的應(yīng)用前景。

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