微型月季花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

宋 杰 ，許 鳳 ，張 露 ，李世峰 ，解瑋佳 ，李樹發(fā) ，王繼華 ，李紳崇

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南昆明 650205；2.云南省花卉育種重點(diǎn)實驗室，云南昆明 650205；3.國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650205）

微型月季（Rosa hybrida var.Minima）是薔薇科薔薇屬多年生灌木，其花、葉、枝、刺等形態(tài)特征都比一般的月季要小，而且花色豐富，花形美麗，株型秀麗可愛，是一種重要的園林觀賞植物，被廣泛用作園林地被和盆花[1-2]。微型月季具有廣闊的市場前景，因此，其新品種的選育工作具有極其重要的價值。

然而，微型月季自交或雜交的結(jié)實率很低，通過雜交這一傳統(tǒng)育種方法選育新品種是微型月季育種的難點(diǎn)。以往國內(nèi)對于微型月季的研究主要集中在繁殖和栽培等方面[3-8]，對于其育種方面的研究也僅限于資源和品種分類[9]、親本分析[10]、花粉形態(tài)[2]等，而關(guān)于微型月季花粉萌發(fā)和花粉管生長方面的研究則鮮見報道。

本研究以微型月季品種Unconditional Love（無條件的愛）為試驗材料，檢測和分析其花粉在不同培養(yǎng)基組分中的花粉萌發(fā)率和花粉管生長長度，并確定最適合其花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基配方，旨在為微型月季的花粉活性檢測和雜交育種的親本選擇提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試花粉的微型月季品種為Unconditional Love（無條件的愛），采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所晉寧大春河基地內(nèi)。2017年4月采集生長健壯的植株上飽滿且未開放的花朵，在實驗室內(nèi)將其花藥從雄蕊上剝下，置于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在干燥皿中干燥至花藥破裂，用試管將散出的花粉進(jìn)行收集，貯藏于-20℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 參考王嵐嵐等[11]的方法，以100 g/L 蔗糖，50 mg/L H3BO3，100 mg/L Ca （NO3）2·4H2O為培養(yǎng)基的基本組分。培養(yǎng)基各組分濃度梯度設(shè)置如表 1 所示。其中，蔗糖、H3BO3和 Ca（NO3）2·4H2O的濃度梯度以不加該物質(zhì)為對照。

表1 培養(yǎng)基各組分濃度梯度

1.2.2 花粉的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時間的確定 采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行花粉培養(yǎng)。萌發(fā)試驗均在花粉采集后24 h內(nèi)進(jìn)行。將收集的花粉充分混勻，用移液槍取制備好的培養(yǎng)液200 μL放入1 mL離心管內(nèi)，加入適量花粉（約用牙簽蘸2次），混合均勻后將離心管放入28℃恒溫箱中暗培養(yǎng)4 h。

1.2.3 花粉萌發(fā)率和花粉管生長長度的測定 用移液槍取15 μL培養(yǎng)4 h后的花粉懸浮液于載玻片上，在帶有攝像系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡（LEICA DM6000 B）下拍照記錄。當(dāng)花粉管生長的長度大于花粉粒的直徑時，認(rèn)為花粉萌發(fā)。通過統(tǒng)計萌發(fā)和未萌發(fā)的花粉粒數(shù)來計算花粉萌發(fā)率，花粉萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)的花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100%。采用顯微鏡自帶的拍照系統(tǒng)測量每個視野中花粉管的長度，從而計算出花粉管生長的平均長度。

每個培養(yǎng)基組分的濃度梯度均設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)觀測5個視野，每個視野內(nèi)所統(tǒng)計的花粉粒數(shù)量大于50粒。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 在單因子試驗的基礎(chǔ)上，選擇對微型月季花粉萌發(fā)影響較大的培養(yǎng)基組分，采用L25（56）正交試驗設(shè)計，優(yōu)化基本培養(yǎng)基組分的最佳組合。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，各處理間差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基組分對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

2.1.1 蔗糖 由圖1可知，花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加先升高而后降低，當(dāng)蔗糖濃度為100 g/L時，花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值（5.23%），且與其他濃度處理間呈顯著性差異。適合花粉管生長的最佳蔗糖濃度為100～250 g/L，此時花粉管的長度為516.07～546.90 μm，但差異不顯著。

2.1.2 硼酸 由圖2可知，當(dāng)硼酸的添加量為0～125 g/L時，花粉萌發(fā)率隨硼酸質(zhì)量濃度的增加而升高，花粉萌發(fā)率在硼酸質(zhì)量濃度為125 mg/L時達(dá)到峰值，為8.47%，之后隨著硼酸質(zhì)量濃度的增加而降低?；ǚ酃苌L的最佳硼酸濃度也為125 mg/L，此時花粉管長度為893.80 μm。

2.1.3 鈣 從圖3可以看出，微型月季Unconditional Love的花粉萌發(fā)率隨著鈣離子濃度的增加同樣呈先升高而后降低的變化趨勢，花粉萌發(fā)率的最高值為 16.34%，出現(xiàn)在 Ca（NO3）2·4H2O 質(zhì)量濃度為150 mg/L時，而且此時花粉管生長的長度最長，為726.61 μm。

2.1.4 鋅、鎂、鉀 由圖4可知，花粉萌發(fā)率和花粉管長度隨著鋅、鎂和鉀的質(zhì)量濃度增加均出現(xiàn)先升高再降低的現(xiàn)象。其中，當(dāng)鋅質(zhì)量濃度為25mg/L時，花粉萌發(fā)率最大（13.04%），鋅質(zhì)量濃度為10 mg/L時，花粉管最長（491.62μm）；鎂質(zhì)量濃度為100mg/L時，花粉萌發(fā)率最大（16.95%），且花粉管最長（497.54 μm）；鉀質(zhì)量濃度為50mg/L時，花粉萌發(fā)率最大（5.02%），鉀質(zhì)量濃度為100 mg/L時，花粉管最長（447.52 μm）。

2.2 蔗糖、B和Ca三因子正交試驗對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影晌

通過單因子試驗，確定蔗糖、硼酸和硝酸鈣這3種組分對微型月季Unconditional love花粉萌發(fā)的影響較大。因此，進(jìn)一步采用正交試驗設(shè)計，篩選這3種組分最佳的組合（表2）。結(jié)果表明，在蔗糖150g/L＋H3BO3125mg/L＋Ca（NO3）2·4H2O100mg/L的處理組中，微型月季Unconditional love的花粉萌發(fā)率最高，為25.10%，且用該培養(yǎng)基培養(yǎng)時，花粉管生長長度為251.13 μm，僅次于蔗糖250 g/L＋H3BO375 mg/L＋Ca（NO3）2·4H2O 200 mg/L 的處理組，且生長良好，未出現(xiàn)異常。

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得到的結(jié)果如表3所示。

從表3方差分析結(jié)果可以看出，蔗糖、H3BO3和Ca（NO3）2·4H2O對花粉萌發(fā)率的影響均達(dá)到顯著水平，3個因子對花粉萌發(fā)率的影響從大到小依次為：蔗糖＞H3BO3＞Ca（NO3）2·4H2O；蔗糖和 H3BO3對花粉管生長長度的影響達(dá)到顯著水平，且影響的顯著性為 H3BO3＞蔗糖，Ca（NO3）2·4H2O對花粉管生長長度的影響未達(dá)到顯著水平。方差分析的結(jié)果與直觀分析的結(jié)果一致。

表2 正交試驗中微型月季Unconditional love花粉的萌發(fā)率和花粉管長度

表3 方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

花粉離體培養(yǎng)需要一定的糖、硼酸和鈣，不同植物花粉萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基不盡相同，它們的濃度大小很大程度上影響著花粉的萌發(fā)和花粉管的生長。糖類物質(zhì)是花粉萌發(fā)及花粉管生長的重要營養(yǎng)成分，在花粉萌發(fā)過程中，能夠為花粉提供能源、調(diào)節(jié)滲透壓，同時，它還是花粉粒萌發(fā)及花粉管壁合成的主要營養(yǎng)物質(zhì)[12-14]。本試驗結(jié)果表明，蔗糖對花粉的萌發(fā)影響顯著。供試的微型月季花粉萌發(fā)率在一定蔗糖濃度范圍內(nèi)，先升高而后降低，在蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L時，花粉萌發(fā)率最高，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度大于200 g/L時，花粉萌發(fā)率開始下降，表明低濃度的蔗糖可促進(jìn)花粉萌發(fā)，而高濃度的蔗糖可能會抑制花粉萌發(fā)，這與許多在其他園藝植物上的研究結(jié)果一致[15-16]。此外，一些針對大花香水類、豐花類和藤本類等月季的花粉萌發(fā)研究認(rèn)為，150～200 g/L的蔗糖濃度為月季花粉最優(yōu)的萌發(fā)條件[11，17-18]，而本研究認(rèn)為，100～150 g/L的蔗糖濃度較適宜微型月季花粉的萌發(fā)，這可能是由微型月季花粉的滲透壓比其他花型較大的月季低所致。

硼酸參與果膠物質(zhì)的合成，有利于花粉管壁的建造[19]。植物缺硼的癥狀首先出現(xiàn)在快速生長的部位，如根尖和花粉管尖端，其特征一般為細(xì)胞壁異常[20]?；ㄖM織中存在的鈣離子主要通過花粉管上的鈣離子通道來調(diào)節(jié)花粉管內(nèi)的動態(tài)變化，從而影響花粉管的生長[21]。一般情況下，植物花粉粒內(nèi)所含的硼和鈣是難以滿足花粉萌發(fā)和花粉管生長需求的，自然狀態(tài)下則由柱頭和花柱內(nèi)的硼和鈣來彌補(bǔ)[22]。但花粉在離體培養(yǎng)時，花粉沒有條件從柱頭和花柱內(nèi)獲取硼和鈣，要滿足花粉的萌發(fā)和花粉管的正常生長，就必須在培養(yǎng)基中添加一定量的外源硼和鈣。植物種類不同，其花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的最適硼酸和鈣離子的濃度也不同。本試驗結(jié)果表明，微型月季花粉離體培養(yǎng)最適宜的硼酸質(zhì)量濃度為 75～125 mg/L，這與 CHRYSOTHEMIS等[17]、王嵐嵐等[11]的研究結(jié)果一致；最適的鈣質(zhì)量濃度是100～150 mg/L，遠(yuǎn)高于 CHRYSOTHEMIS 等[17]研究得出的10 mg/L為最適濃度，這可能是由微型月季的特殊性所致。

鎂在植物核酸和蛋白質(zhì)代謝中起重要作用；鉀在植物的糖類物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝及呼吸作用中起重要作用，同時鉀也是構(gòu)成植物細(xì)胞滲透勢的重要物質(zhì)；鋅是吲哚乙酸合成所必需的元素，進(jìn)而對蛋白質(zhì)的合成有促進(jìn)作用。本試驗結(jié)果表明，適宜濃度的鎂、鉀、鋅對微型月季花粉的萌發(fā)均有促進(jìn)作用，且其對微型月季花粉萌發(fā)促進(jìn)作用的大小依次為鎂、鋅、鉀。這與王嵐嵐等[11]的研究結(jié)果認(rèn)為，鎂和鉀的濃度梯度變化對月季花粉萌發(fā)率無顯著性差異的結(jié)果有出入。究其原因，應(yīng)該是本試驗是在含有蔗糖、硼酸和鈣的基本培養(yǎng)基中再添加鎂、鉀和鋅元素所致，也說明該3種礦質(zhì)元素與蔗糖、硼酸和鈣對促進(jìn)花粉萌發(fā)起協(xié)同作用，而單獨(dú)使用并沒有效果。

本研究通過正交試驗設(shè)計，確定微型月季花粉萌發(fā)最佳的基本培養(yǎng)基為蔗糖150 g/L＋H3BO3125 mg/L＋Ca（NO3）2·4H2O100 mg/L。培養(yǎng)基組分中蔗糖、硼酸對微型月季花粉萌發(fā)和花粉管的生長有顯著影響，鈣對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響弱于蔗糖和硼酸，其主要是通過協(xié)助蔗糖和硼酸而發(fā)揮作用，但這種作用也是微型月季花粉萌發(fā)所不可或缺的。

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