番茄灰霉病菌內(nèi)生拮抗細菌的篩選及鑒定

馬 超，朱洪磊，黃太偉，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801）

番茄灰霉病是影響番茄種植的重要病害之一。其在各種植區(qū)均有發(fā)生，特別是對保護地番茄生產(chǎn)造成極大威脅，可造成減產(chǎn)40%～50%，甚至達60%以上[1]。番茄灰霉病病原為半知菌亞門的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），除為害番茄外，還可為害辣椒、茄子、黃瓜等200多種作物[2]。寄主的莖、葉、花、果均可為害，但通常以青果發(fā)病較重。病癥初呈水浸狀斑點，后擴展為長圓形或不規(guī)則形病斑，濕度大時形成灰色的霉層，可產(chǎn)生大量的分生孢子及分生孢子梗，分生孢子可借助氣流、雨水濺射或農(nóng)事操作等迅速傳播、繁殖、為害。持續(xù)的化學防治措施的實施，一方面可導致果實農(nóng)藥殘留增加的風險；一方面噴施時，施藥器械產(chǎn)生的氣流也助長了病原菌分生孢子的傳播；再次，番茄灰霉病菌抗藥性問題等導致化學藥劑防治困難，生產(chǎn)上番茄灰霉病頻發(fā)[3-4]。

利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物來防治番茄灰霉病已成為一種有效且綠色環(huán)保的病害防治途徑。國內(nèi)外關于利用有益微生物防控番茄灰霉病的研究已有很多報道，篩選出了包括哈茨木霉、粘帚霉、芽孢桿菌、熒光假單孢菌、鏈霉菌等多種對番茄灰霉菌具有良好抑菌效果的有益微生物，并且一些已被開發(fā)為制劑應用于生產(chǎn)[5-6]。

植物內(nèi)生菌是定殖在健康植物組織內(nèi)，并與植物建立和諧聯(lián)合關系的一類微生物，一方面植物內(nèi)生菌可通過分泌抗菌物質(zhì)，提高植物抗病、抗逆能力，另一方面植物內(nèi)生菌定殖于植物組織內(nèi)部，可受到植物組織的保護，比暴露于惡劣環(huán)境中的附生微生物具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，更易于其生物功能的發(fā)揮。

本研究主要從健康梓樹的根部和莖葉部分離內(nèi)生細菌，并通過其次生代謝物的抑菌活性測定、拮抗菌株分類地位的鑒定等，篩選出對番茄灰霉病有明顯抑制效果的內(nèi)生拮抗細菌，以期為番茄灰霉病的微生物防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：植物內(nèi)生細菌GZ-1，GZ-2，GZ-3，GZ-4，GZ-5，GZ-6，GZ-7，GZ-8，GZ-9，GZ-10，GZ-11和GZ-12菌株，分離自山西農(nóng)業(yè)大學校園梓樹的根、莖、葉等不同部位。

供試植物病原菌：番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）FQ-1、番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）FQ-2、草莓灰霉病菌（Botrytis cirerea）CM-1、草莓灰霉病菌（Botrytis cirerea）CM-2、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersic）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cirerea）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、西瓜枯萎病菌（Fusarim oxysporum f.sp.niveum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum），均為山西省綠色生物農(nóng)藥工程技術中心保存菌種。

1.2 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法[7]，以番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和番茄枯萎病菌等3種病原菌為指示菌，對12株內(nèi)生細菌的抑菌活性進行測定[8]。并采用十字交叉法測量對照組直徑和處理組直徑，計算抑菌率，以不接內(nèi)生細菌為對照，3次重復。

1.3 拮抗菌株發(fā)酵液活性測定

采用生長速率法[8]，以番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和番茄枯萎病菌等3種病原菌為指示菌，測定12株內(nèi)生細菌的抑菌活性。將12個菌株分別接種于BPY液體培養(yǎng)液中[8]，30℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，將發(fā)酵液以8 500 r/min離心15 min后收集上清液，并將所得上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到過濾后的發(fā)酵液以1∶9（V∶V）的比例與PDA培養(yǎng)基混合制備平板，取直徑為5 mm病原菌接種于平板中央，并在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測定病原菌的直徑，計算其抑菌率。以無菌發(fā)酵液為對照，3次重復，并計算抑菌率。

1.4 GZ-5和GZ-3菌株抑菌譜測定

采用生長速率法，并以番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜灰霉病菌等植物病原菌作為指示菌，測定GZ-5和GZ-3菌株的抑菌活性及抑菌廣譜性，測定方法同1.2。

1.5 拮抗菌株的分類鑒定

1.5.1 形態(tài)特征及生理生化 依據(jù)《Bergey's manu al ofdeterminative Bacteriology》[9]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。根據(jù)菌落特性、菌體形態(tài)大小和菌株菌體的生理生化反應等對內(nèi)生細菌進行初步的鑒定。

1.5.2 16S rDNA序列分析測定及同源性比對 細菌DNA的提取采用蛋白酶/SDS法制備[11]，采用細菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增16S rDNA基因序列。PCR擴增反應體系（50 μL）：10×buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物 27F（10 mmol/L）1 μL，引物 1492R（10 mmol/L）1 μL，Taq 酶（5 U/L）0.5 μL，3 μL上清液作為模板，ddH2O37.5 μL。PCR 反應程序：95 ℃，5 min，94℃，30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，10℃保存。純化后的PCR產(chǎn)物送至北京華大基因科技股份有限公司測序。測序后在NCBI上進行同源性分析，結(jié)合形態(tài)學特征和生理生化測定結(jié)果，初步鑒定出該菌株的分類地位，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

表1 12株內(nèi)生細菌對不同病原真菌對峙培養(yǎng)抑菌帶分析 mm

從表1可以看出，12株內(nèi)生細菌對3種植物病原菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中，GZ-5，GZ-3，GZ-7和GZ-10菌株均對3種病原菌表現(xiàn)出較強的抑菌帶，尤其GZ-5菌株對番茄灰霉病菌的抑菌作用最強，抑菌帶為14.1 mm，GZ-3菌株對番茄灰霉病菌的抑菌帶可達13.0 mm。

2.2 拮抗菌株發(fā)酵液活性測定分析

由表2可知，12株內(nèi)生菌的發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑制率最高的是 GZ-5，GZ-3，GZ-7，GZ-4和GZ-11菌株，其抑制率均在80%以上；其中，GZ-5，GZ-3菌株對番茄早疫病菌也具有良好的抑菌活性，其抑制率分別可達85.5%和82.3%，對番茄枯萎病菌的抑制率也在50%以上?？傮w分析，GZ-5和GZ-3菌株對3種植物病原菌的抑制活性較好，值得進一步研究。

表2 12株內(nèi)生細菌發(fā)酵液對不同病原真菌的抑菌活性分析 %

2.3 GZ-5和GZ-3菌株抑菌活性及抑菌譜分析

表3 2株內(nèi)生細菌代謝物對10種植物病原真菌的抑制活性分析 %

GZ-5和GZ-3菌株代謝物對5種灰霉病菌及其他5種病原真菌的抑菌效果如表3所示，2株內(nèi)生細菌的代謝物質(zhì)均對10株病原真菌均有一定的抑制作用。其中，GZ-5菌株對所測病原真菌的抑制率在42.03%～85.87%（圖1）；GZ-3菌株對所測病原真菌的抑制率在56.30%～88.63%，表明2個菌株具有較好的廣譜性，且GZ-5菌株代謝發(fā)酵產(chǎn)物對5種灰霉病原菌的抑制率高于GZ-3菌株，GZ-3菌株代謝發(fā)酵產(chǎn)物對另外5種病原菌的抑制率高于GZ-5菌株，這還有待于進一步分析。

2.4 GZ-5和GZ-3菌株的分類鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)特征及生理生化反應結(jié)果 在NA培養(yǎng)基上，菌株GZ-5的菌落呈米白色，表面褶皺不透明，邊緣呈現(xiàn)裂紋。菌株GZ-3的菌落呈米黃色，不透明，不光滑，與培養(yǎng)基接觸不緊密。

2個菌株的生理生化特性如表4所示。經(jīng)接觸酶、厭氧性、MR和C/N利用等特性的測定結(jié)果表明，2個菌株的生理生化特性均具有芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌的典型特征。

表4 GZ-3和GZ-5菌株生理生化反應

2.4.2 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴增產(chǎn)物片段約為1.5 kb，與預期目標大小一致，從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關屬及種的16S rDNA基因序列，以16S rDNA基因序列為基礎構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，其中，GZ-5菌株與解淀粉芽孢桿菌聚為一類，與Bacillus amyloliquefaciens（登錄號KT381096.1）相似度達100%。GZ-3菌株與地衣芽孢桿菌聚為一類，與Bacillus licheniformis（登錄號EF656455.1）相似度為99%。

結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析等，初步將GZ-5菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌，GZ-3菌株為地衣芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細菌作為植物有益微生物的重要組成部分，利用其協(xié)助宿主植物抵制病原菌侵染已經(jīng)開展了許多的研究。通過大量的分離、純化、鑒定測定一些細菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)一些植物內(nèi)生菌具有一菌多防的效果。曲田麗等[12]從植物合歡葉分離的內(nèi)生菌H8對6種病原菌都有抑制作用；吳紅玉等[13]從核桃分離出1株內(nèi)生菌，其發(fā)酵濾液對多種病原菌都有抑制作用；YANG等[14]從冬凌草中分離出1株對多種病原真菌具有拮抗作用的內(nèi)生細菌；李寧[15]從油菜中分離出的內(nèi)生拮抗細菌SF3，SF4均對核盤菌及多種病原真菌有拮抗作用。并且植物內(nèi)生菌代謝中的抑菌物質(zhì)具有很好的開發(fā)利用價值，為宿主植物抵抗外來病原菌的入侵奠定了基礎。GONG等[16]研究表明，內(nèi)生細菌代謝物中存在可以抑制植物病原真菌的抗菌脂肽；歐雄常等[17]研究表明，紅樹內(nèi)生細菌AmS2發(fā)酵液甲醇提取物對多種植物病原真菌有抑制作用；李晨楚等[18]研究表明，對多種病原菌有較強抑制作用的枯草芽孢桿菌B43能夠產(chǎn)生多種脂肽類抗生素；陳梅春等[19]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽胞桿菌FJAT-4產(chǎn)生的抑菌脂肽會致使尖孢鐮刀菌菌絲體發(fā)育畸形。本研究所篩選的GZ-5菌株及GZ-3菌株經(jīng)初步鑒定分別為解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，2個菌株不僅對灰葡萄孢菌多菌株、尖孢鐮刀菌多菌株有較好的拮抗性，而且對所測多種病原真菌具有抑菌活性，但在對不同類病原菌的抑制率上存在差異，具有顯著差異性，其具體原因有待于進一步分析。關于2個菌株的發(fā)酵條件、抗菌物質(zhì)類型、抑菌機理等仍需進一步研究。

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