八角提取物對(duì)多種植物病原真菌的抑制作用

程慧麗，趙慧琳，楊蘇蘇，郝曉娟，楊 春，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

八角（Illicium verum Hook.f.）是雙子葉植物綱木蘭科八角屬的一種[1]，又稱八角茴香、大茴香、大料、五香八角等[2]，主要分布于我國(guó)的廣西、廣東、云南等以及東南亞地區(qū)，大部分為野生種，生長(zhǎng)于天然雜木林內(nèi)，是一種多年生的常綠喬木。其干燥成熟的果實(shí)中含有5%～8%的芳香油、約22%的脂肪油以及少量的蛋白質(zhì)、樹脂等[3]，是優(yōu)良的食品調(diào)料和中藥。八角作為香辛料在我國(guó)已使用數(shù)百年，其可增香調(diào)味和配制鹵湯[4]；作為中藥，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛[5]、抑菌等作用[6-7]，還被廣泛應(yīng)用于化妝品中（如牙膏、香皂等[11]）。

八角熟材不僅氣味宜人，而且不受蟲蛀。近年來，有研究表明，從天然八角茴香中提取得到的精油，具有較好的殺蟲活性和抗自由基氧化的作用[8]，可作為食品天然防腐劑和抗菌劑。此外，八角茴香水煎劑對(duì)結(jié)核桿菌及枯草桿菌具有抑制作用，其乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎球菌及一些常見的致病性念珠菌具有抑制作用[9-10]。劉志希等[11]研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香精油及其主要成分反式茴香醚對(duì)棉花枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。陸寧海等[12]研究結(jié)果表明，八角茴香的4種不同溶劑提取物對(duì)水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、大蔥紫斑病菌（Alternaria porri）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）和棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）4 種植物病原菌都具有一定的抑制作用，丙酮和二甲苯提取八角茴香抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，甲醇次之，乙醇相對(duì)較弱。

本試驗(yàn)根據(jù)八角茴香精油及其主要成分對(duì)植物病原真菌的抑制作用，采用生長(zhǎng)速率法，測(cè)定八角提取物對(duì)不同供試菌種的抑制效果[13-14]，以篩選出作用效果較好的菌種，為進(jìn)一步研究、開發(fā)八角的農(nóng)用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 供試植物材料為八角果實(shí)提取物（購(gòu)自太谷縣中藥市場(chǎng)）。

1.1.2 供試菌種 香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）、番茄早疫病菌（Alterrnaria solani）、番茄黑斑病菌（Pesudomonas syringae）、蘭花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana）、核枯梢病菌（Phomopsis macrospora）、三七根腐病菌（Cylindrocaipon destructans）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、甜瓜枯萎病菌（Fasarium oxysporum）、梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、豆角炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum）、棗炭疽病菌 （Colletotrichum gloeosporioidies）、葡萄根腐病菌（Fusarium oxysporum）、番茄枯萎病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、辣椒灰霉病菌 （Botrytis cinerea）、 茄子 枯 萎病 菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、蘋果樹腐爛病菌（Cytospora mandshurica）西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）等20種病菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)分離純化后，在PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑和主要儀器 化學(xué)試劑為丙酮分析純。主要儀器為1702-MP8型電子天平、100～1 000 mL移液器、微波爐、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超凈操作臺(tái)、成像顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 稱取馬鈴薯200 g，加入1 000 mL水，煮沸0.5 h，用紗布過濾汁液，然后加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，加水補(bǔ)充到1 000 mL，分裝錐形瓶，放入滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，常溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 八角初提取物的制備 稱量45 g八角回香，研磨成粉末后，與225 mL的丙酮裝入浸提缸內(nèi)；用超聲波（室溫、1 h）提取[15]，靜置 12 h 后，用真空抽濾泵進(jìn)行抽濾；將抽濾液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至一定濃度，測(cè)定其濃度；將抽濾完的八角回香再次在相同條件下提取，重復(fù)以上操作3次；將3次的提取物質(zhì)量相加，計(jì)算八角茴香的提取率及測(cè)定其濃度。

1.2.3 1 mg/mL八角提取物的制備 取八角丙酮提取物1 mL于離心管中，進(jìn)行離心真空抽提后稱質(zhì)量，測(cè)定八角丙酮提取物的質(zhì)量濃度為40 mg/mL。取0.5 mL的藥物提取液于離心管中，加入滅菌后的培養(yǎng)基定容至20 mL，用振蕩器混合均勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的備用藥液。丙酮對(duì)照用相同方法配制。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定 八角茴香提取物對(duì)20種病原菌絲生長(zhǎng)的抑制作用采用生長(zhǎng)速率測(cè)定法[16]進(jìn)行，用打孔器（6 mm）在菌落邊緣菌絲生長(zhǎng)茂盛的地方打孔，用接種針接種至加藥的PDA平板上培養(yǎng)（藥與培養(yǎng)基比為1∶19），同時(shí)以培養(yǎng)基內(nèi)加入一定比例的丙酮為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25℃下恒溫培養(yǎng)。用十字交叉法測(cè)定每個(gè)菌落的直徑，以其平均值代表菌落的直徑（上述一系列操作必須在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行）。

菌絲生長(zhǎng)抑制率＝（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－0.6 cm）×100%（1）

1.2.5 八角提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響 在PDA培養(yǎng)基中加入一定量的八角提取物，配制成含八角提取物濃度為0.1 mg/mL的PDA培養(yǎng)基，用打孔器（直徑6 mm）在生長(zhǎng)旺盛的番茄灰霉病菌的菌落邊緣打取菌餅，用接種針將菌餅接入事先準(zhǔn)備好的含藥培養(yǎng)基上，以培養(yǎng)基內(nèi)加同等比例的丙酮培養(yǎng)基作為對(duì)照，在適宜的條件下振蕩培養(yǎng)（150 r/min，25℃）。處理72 h之后，分別挑取處理組和對(duì)照組的菌絲，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗菌絲表面的培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角提取物對(duì)不同病菌生長(zhǎng)速率的影響

試驗(yàn)分別對(duì)比了1 mg/mL八角提取物不同病菌的抑制作用，結(jié)果列于表1。

從表1可以看出，在八角提取物質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌和辣椒灰霉病菌的抑制效果最為明顯，對(duì)這2種病原菌的抑制率都在96%以上，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌效果相對(duì)穩(wěn)定；對(duì)其他18種病原真菌的抑菌率也都在45%以上。所以，以番茄灰霉病菌為供試菌，研究不同質(zhì)量濃度的八角提取物對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)速率的抑制效果。

表1 八角提取物對(duì)不同病菌的抑制作用 %

2.2 不同濃度八角提取物對(duì)番茄灰霉病菌的毒力作用

根據(jù)上述試驗(yàn)對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果，設(shè)置 1（A），0.5（B），0.25（C），0.125（D），0.062 5（E），0（F）mg/mL不同濃度梯度的八角提取物溶液，觀察其經(jīng)過48，72，96 h的抑菌效果，其結(jié)果如圖1所示。為進(jìn)一步研究本試驗(yàn)中八角茴香提取物對(duì)番茄灰霉病菌抑制最佳時(shí)間和最強(qiáng)抑制效果，分別計(jì)算出八角茴香提取物在48，72，96 h時(shí)，番茄灰霉病菌的毒力回歸方程（y＝ax＋b）、抑制作用的有效濃度（EC50）以及相關(guān)系數(shù)（表2）。

由表2可知，在不同時(shí)間內(nèi)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)無限趨近于1時(shí)，變數(shù)間的關(guān)系接近于直線相關(guān)。此外，以番茄灰霉病菌作為供試菌，在48 h時(shí)，有效中濃度EC50值為0.135 3 mg/mL，與72，96 h時(shí)的EC50值相比最小。由此可知，八角提取物對(duì)番茄灰霉病菌在48 h內(nèi)抑菌效果較好。

表2 八角提取物對(duì)番茄灰霉病菌的毒力

2.3 八角提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響

圖2為供試菌在不含八角提取物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，圖3為供試菌在含有八角提取物濃度為0.125 mg/mL時(shí)的生長(zhǎng)狀況。與圖2（對(duì)照組）相比，在含藥培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌絲粗細(xì)程度不一，菌絲表面多有凹凸，菌絲內(nèi)溶物變少或者流失（圖3）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以20種供試菌種作為篩選樣本，檢驗(yàn)八角提取物的抑制作用，結(jié)果表明，其提取物對(duì)多種病原菌的抑制效果較好，其中，對(duì)于番茄灰霉病和辣椒灰霉病效果顯著，抑制率均達(dá)到96%以上，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，作用效果相對(duì)比較穩(wěn)定。此外，以番茄灰霉病菌作為供試菌，在48 h時(shí)，有效中濃度EC50值為0.135 3 mg/mL，所以，八角提取物對(duì)番茄灰霉病菌在48 h內(nèi)抑菌效果明顯。通過在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)，可以明顯地觀察到菌絲的變化，菌絲表面出現(xiàn)凹凸，內(nèi)溶物流失，為進(jìn)一步研究八角提取物對(duì)番茄灰霉病的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

我國(guó)物產(chǎn)豐富，許多植物資源尚未得到充分利用。八角為我國(guó)南方的特產(chǎn)香辛料，不僅是一種“藥食同源”的經(jīng)濟(jì)物種，而且其代謝產(chǎn)物中富含多種活性成分，開發(fā)價(jià)值巨大[18]。本試驗(yàn)從人們關(guān)注的環(huán)保出發(fā)，對(duì)八角茴香果實(shí)提取物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，但并未對(duì)其他部位的提取物進(jìn)行藥效試驗(yàn)，不能確定其抑菌活性。八角茴香提取物在室內(nèi)試驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的抑菌效果，但其是否在活體盆栽試驗(yàn)以及室外試驗(yàn)中也能表現(xiàn)出顯著的抑菌效果，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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