pIRES2-EGFP-prnd真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在BHK細(xì)胞中的表達(dá)

程艷芬 ，寧章勇 ，馮翠萍 ，趙孟孟 ，安玉甫 ，吳新濤

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

傳染性海綿狀腦?。═ransmissible spongiform encephalopathy，TSE）是人與動物共患的神經(jīng)性疾病[1]。許多研究表明，該病是由朊蛋白質(zhì)錯誤折疊引起的，即正常細(xì)胞內(nèi)源性的朊蛋白PrPc翻譯后變?yōu)楦缓抡郫BPrPsc引起的[2-3]。但其發(fā)病機理仍然不清楚。疊朊蛋白（Prnp downstreamprion-like protein，Doppel）是由prnd基因編碼的，位于朊蛋白基因的下游，與朊蛋白基因具有生化及結(jié)構(gòu)的同源性，由于PrPsc是PrP的同工型，被認(rèn)為是朊病毒病的病原[4]，因此，分離并純化Dpl蛋白被認(rèn)為能夠幫助進(jìn)一步描繪PrP的功能，并鑒定PrP和Doppel與TSE的潛在相關(guān)性，然而，Doppel是否參與TSE的發(fā)生依然是一個有爭議的問題。已有研究表明，Doppel參與了多種神經(jīng)細(xì)胞的死亡、凋亡與退化的過程[5-7]以及多種組織學(xué)來源的腫瘤的發(fā)生[8]。因此，獲得Doppel的生理生化表達(dá)是深入研究Doppel功能的必要步驟。

Doppel與PrPc雖然結(jié)構(gòu)上極為相似，但是組織學(xué)分布和生理功能有明顯差異[8]。目前，Doppel蛋白還無法大量從組織中純化，而獲得較純的Doppel蛋白對于研究其結(jié)構(gòu)和功能及在相關(guān)疾病中的作用至關(guān)重要。原核表達(dá)的Doppel蛋白由于缺乏翻譯后折疊、加工、修飾和轉(zhuǎn)運，無法精準(zhǔn)地展示其生物學(xué)特性及生理生化功能，因此，不是研究Doppel蛋白結(jié)構(gòu)和功能的首選。BHK細(xì)胞為幼地鼠腎細(xì)胞，其本身沒有疊朊蛋白的表達(dá)，為實驗室一直保存，轉(zhuǎn)染相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒后，所檢測到的疊朊蛋白全都來自克隆的載體。

本研究構(gòu)建BALB/c小鼠Doppel基因prnd的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-prnd，并使其在BHK細(xì)胞中獲得表達(dá)，為進(jìn)一步研究Doppel蛋白的結(jié)構(gòu)、正常的生理生化功能及其與相關(guān)疾病的關(guān)系提供了重要工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 BHK細(xì)胞系、大腸桿菌JM109和pMD18-T Vector為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理教研室保存；pIRES2-EGFP Vector購自Clonetech公司。

1.1.2 BALB/c小鼠 其購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，6周齡，雄性，SPF級。

1.1.3 主要試劑 DMEM等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自Gibco公司；RNA提取、DNA連接酶等基因克隆相關(guān)試劑購自大連寶生物工程有限公司；prnd多克隆抗體購自ProteinTech Group公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1BALB/c小鼠睪丸總RNA的提取 將BALB/c小鼠麻醉后處死，取睪丸組織，按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA第一鏈的合成和PCR反應(yīng) 按照試劑盒說明書提取cDNA，于-20℃保存。

參照GenBank登錄的BALB/c小鼠prion protein-likeproteinmRNACDS區(qū)（登錄號 GQ245668.1）設(shè)計1對引物，上游引物：5′-CCGCTCGAGAGGGG CATAAAGCATAGGTTC-3′，含有 Xho I位點；下游引物：5′-ATAACTGCAGGGCTCCCCTTTCCAGCCA GA-3′，含有Pst I位點。目的片斷長度約為400 bp。引物由Takara公司合成。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，其中，cDNA模板2 μL，prnd基因上下游引物稀釋至 12.5 pmol/L，各加 1 μL，Ex Taq 酶 0.2 μL，dNTP Mixture 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，66 ℃ 40 s，72℃ 50 s，38 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.3 pMD18-T-prnd的構(gòu)建和鑒定 按照常規(guī)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-prnd。

1.2.4 pIRES2-EGFP-prnd的構(gòu)建 對pIRES2-EGFP和pMD18-T-prnd同時進(jìn)行Xho I，Pst I雙酶切，常規(guī)方法進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒。酶切并測序確認(rèn)目的片段正確插入，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pIRES2-EGFP-prnd。

1.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 用常規(guī)方法復(fù)蘇BHK細(xì)胞，參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將pIRES2-EGFP-prnd轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24，48 h后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.6 IFA檢測 用100%甲醇固定[9]轉(zhuǎn)染后24，48 h的BHK細(xì)胞，常規(guī)方法進(jìn)行IFA檢測，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 prnd基因RT-PCR產(chǎn)物的克隆鑒定

經(jīng)擴增得到1條約500bp的清晰條帶。pMD18-T-prnd 經(jīng) XhoI，PstI雙酶切后，獲得約 500，2900bp的2條酶切片段（圖1），測序結(jié)果也表明克隆成功。

2.2 pIRES2-EGFP-prnd的構(gòu)建

pIRES2-EGFP-prnd的雙酶切鑒定結(jié)果表明，pIRES2-EGFP-prnd構(gòu)建成功（圖1）。

2.3 BALB/c小鼠基因prnd在BHK細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒到BHK細(xì)胞1，2 d后，分別用熒光顯微鏡觀察到非常明顯的熒光（圖2），表明prnd基因和EGFP基因可以在BHK細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)染后BHK細(xì)胞的IFA檢測

對100%甲醇固定的BHK細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）檢測，結(jié)果如圖3所示。在熒光顯微鏡下，可以看到BHK細(xì)胞有熒光的表達(dá)，表明pIRES2-EGFP-prnd質(zhì)粒中的prnd基因在BHK細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生Doppel蛋白。

3 討論

Doppel是朊蛋白家族的成員，至今仍不清楚其正常的生理功能。對其正常生理功能的正確詮釋是研究其在相關(guān)疾病發(fā)生過程中的作用必不可少的。已有研究表明，Doppel在正常的骨髓細(xì)胞中難以被檢測到，而幾乎所有的骨髓疾病患者如急性骨髓白血病和骨髓發(fā)育異常綜合癥患者的骨髓細(xì)胞中都能檢測到Doppel的表達(dá)[10-11]，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，Doppel的表達(dá)水平與骨髓疾病相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇抑笜?biāo)關(guān)系不大，不能用來預(yù)測骨髓疾病的發(fā)生。但是，在骨髓發(fā)育異常綜合癥發(fā)展為急性骨髓白血病的過程中，Doppel的表達(dá)水平顯著升高，可以作為評估臨床骨髓疾病發(fā)展的依據(jù)[12]。此外，Doppel在星形細(xì)胞瘤及其他組織來源腫瘤的患者體內(nèi)表達(dá)顯著升高，其在這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的功能還需要進(jìn)一步研究[11，13]。獲得Doppel的正常表達(dá)水平以及其表達(dá)水平升高導(dǎo)致的生理功能的改變是深入研究其在TSE及腫瘤等相關(guān)疾病診斷中功能的必要步驟。本研究初步構(gòu)建了Doppel蛋白的基因工程細(xì)胞，為進(jìn)一步研究在細(xì)胞水平上Doppel蛋白的正常結(jié)構(gòu)和生物學(xué)意義以及其與相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

prnd的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和表達(dá)產(chǎn)物的分布在不同組織、不同發(fā)育階段差異很大[14]。在新生敘利亞倉鼠的大腦皮層中，只能檢測到prnd mRNA的表達(dá)，Doppel蛋白的表達(dá)無法用現(xiàn)有手段檢測到；成年后，其大腦皮層中prnd mRNA的表達(dá)也檢測不到。而無論新生的還是成年的敘利亞倉鼠，睪丸是包括心、脾、腦、骨髓、肌肉中prnd mRNA及其相關(guān)蛋白的表達(dá)量最高的組織[15]。BALB/c小鼠是研究神經(jīng)退行性疾病的重要動物模型，因此，用發(fā)育成熟的BALB/c小鼠的睪丸組織是提取prnd基因的最佳材料選擇。

本研究將目的基因插到質(zhì)粒pIRES2-EGFP綠色熒光蛋白的啟動子后，與綠色熒光蛋白的基因緊密連鎖，使目的基因和綠色熒光蛋白同步表達(dá)，檢測靈敏度高，非常適合基因功能的研究[16-18]。BHK細(xì)胞在被甲醇固定時其內(nèi)質(zhì)粒載體所帶的綠色熒光猝滅，不影響做IFA時用綠色熒光二抗[19-20]。

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