芪貞增免顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高

杜紅娜 ，陸 安 ?，劉炳煒 ，李 芳 ，賈永兵 ，王曄娜 ，賀丙強(qiáng) ，郭永紅

（1.河北普德動(dòng)物藥業(yè)有限公司 050200；2.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術(shù)研究中心 050200；3.河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司 050200）

芪貞增免顆粒（商品名：紅利來(lái)）收載于2012版《國(guó)家獸藥標(biāo)準(zhǔn)匯編-獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》第三冊(cè)[1]，是由黃芪、淫羊藿和女貞子組成的，用于提高家禽、家畜免疫力，抗病毒。原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，只有黃芪和淫羊藿的薄層色譜（TLC）鑒別項(xiàng)，沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。為更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究在現(xiàn)有TLC鑒別的基礎(chǔ)上，增加了含量測(cè)定項(xiàng)，通過(guò)試驗(yàn)研究，建立了黃芪多糖、特女貞苷和淫羊藿苷的含量測(cè)定方法，進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。研究結(jié)果顯示，方法可行且專屬性較強(qiáng)，可更科學(xué)、全面地控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，DAD檢測(cè)器，變色龍工作站（賽默飛世爾科技有限公司）；AUW120D型電子天平（日本SHIMADZU公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（龍口市電爐制造廠）。

1.2 試劑與對(duì)照品

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781-201713，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%），特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)111926-201705，含量93.5%），淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)110737-201405）上述對(duì)照品及對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；純凈水。

1.3 藥材

黃芪、淫羊藿和女貞子均購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)本公司質(zhì)控部檢驗(yàn)，均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》[2]2015版（Ⅱ部）有關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪的薄層鑒別

參考《中華人民共和國(guó)藥典》[1]2015版（I部）黃芪藥材的處理方法，使用三氯甲烷甲醇—水（13∶7∶2）的下層溶液為展開(kāi)劑，對(duì)試驗(yàn)所用黃芪藥材進(jìn)行鑒別。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪TLC色譜圖

2.1.2 淫羊藿的薄層鑒別

參考《中華人民共和國(guó)藥典》[1]2015版（I部）淫羊藿藥材的處理方法，使用乙酯丁酮—甲酸—水（10∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，對(duì)試驗(yàn)所用淫羊藿藥材進(jìn)行鑒別。見(jiàn)圖2。

2.2 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈—水（33∶67）為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4500。

2.2.2 供試品及陰性樣品溶液的制備

參考中國(guó)藥典[1]中黃芪飲片項(xiàng)下的樣品處理方法，供試品經(jīng)過(guò)超聲、萃取之后再通過(guò)D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為1.05cm，柱高為12cm），用不同濃度的乙醇溶液洗脫，洗脫液蒸干后用甲醇定容，即得。按供試品制備方法制備不含黃芪的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

圖2 淫羊藿TLC色譜圖

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，即得。

2.2.4 專屬性考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察方法專屬性。結(jié)果表明，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各成分HPLC色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系

稱定黃芪甲苷對(duì)照品21.56mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL 的對(duì)照品貯備液，分別置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即制備成濃度分別為0.0840m g·mL-1，0.1680mg·mL-1，0.2520mg·mL-1，0.3360mg·mL-1，0.4200mg·mL-1，0.5040mg·mL-1的對(duì)照品溶液。 分別精密量取 10μL 注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。黃芪甲苷進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，色譜峰面積常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，建立線性回歸回歸方程：lgY=0.1329lgX+0.3824（r=0.9997），其中 X 為黃芪甲苷的進(jìn)樣量，Y為色譜圖中黃芪甲苷峰的峰面積，結(jié)果表明黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.840～5.040μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 重復(fù)性考察

取同一批樣品（批次：20180301），按取樣量0.5∶1.0∶1.5的比例分別取樣，各平行3份，按供試品溶液制備方法制備，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷的平均含量及含量的RSD值，考察方法的重復(fù)性。測(cè)得黃芪甲苷平均含量為0.52mg·g-1，RSD值為1.73%，重復(fù)性良好。

2.2.7 精密度考察

取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄色譜峰峰面積并計(jì)算峰面積的RSD值。測(cè)得黃芪甲苷色譜峰峰面積RSD值為0.36%，精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于 0h，4h，8h，12h，18h 和 24h 進(jìn)樣分析，分別記錄黃芪甲苷峰面積并計(jì)算峰面積的RSD值。測(cè)得黃芪甲苷色譜峰峰面積RSD值為0.68%，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 準(zhǔn)確度考察

取同一批樣品（批次：20180301）2.5g，平行9份，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按確定的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

上述結(jié)果表明：9份供試品溶液中，黃芪甲苷的回收率均在98%～102%之間，回收率平均值為100.39%，RSD值為1.09%（n=9），回收率良好，準(zhǔn)確度符合要求。

2.3 特女貞苷和淫羊藿苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件色譜柱

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈—水； 流速：1.0mL·min-1； 檢測(cè)波長(zhǎng) 0～30min 為 224nm，30～50min為 270nm。 柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

2.3.2 供試品及陰性樣品溶液的制備

取本品1g，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。按供試品制備工藝制備不含女貞子和淫羊藿的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備

取特女貞苷、淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含特女貞苷、淫羊藿苷各150μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3.4 專屬性考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3.5 線性關(guān)系考察

稱取特女貞苷和淫羊藿苷對(duì)照品各10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，1，2，3，6mL，分別置25mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液。各精密量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以特女貞苷和淫羊藿苷濃度為橫坐標(biāo)（X，μg·mL-1），色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：特女貞苷：Y=0.199X+0.0341，（r=1），淫羊藿苷：Y=0.1537X-0.2736，（r=0.9997），分別在 10.0012～250.0300μg·mL-1、10.0185～250.4625μg·mL-1范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

2.3.6 重復(fù)性考察

取同一批樣品（批次：20180301），按取樣量 0.5∶1.0∶1.5的比例分別取樣，各平行3份，按2.3.2方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，特女貞苷和淫羊藿苷平均含量分別為6.20mg·g-1和 3.25mg·g-1，RSD 值為分別為 1.21%和 1.33%，該方法重復(fù)性良好。

圖4 各成分HPLC色譜圖

2.3.7 精密度考察

取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值。特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積RSD值分別為0.47%和0.23%，精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于 0h，4h，8h，12h，18h 和 24h 進(jìn)樣分析，記錄特女貞苷和淫羊藿苷峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值。特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積RSD值分別為0.28%和0.37%，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 準(zhǔn)確度考察

取同一批樣品（批次：20180301）2.5g，平行 9份，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的特女貞苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按2.3.2方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

上述結(jié)果顯示：9份供試品溶液中，特女貞苷的回收率均介于98%～102%之間，回收率均值為100.56%，RSD值為1.28%（n=9），該方法回收率良好。9份供試品溶液中，淫羊藿苷苷的回收率均介于98%～102%之間，回收率均值為99.80%，RSD值為1.01%（n=9），該方法準(zhǔn)確度符合要求。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

3 討論

本研究參考藥典[1]方法，完成黃芪和淫羊藿TLC鑒別；同時(shí)，對(duì)“女貞子”的鑒別進(jìn)行了研究，初步摸索發(fā)現(xiàn)陰性樣品存在干擾，調(diào)整展開(kāi)劑系統(tǒng)及供試品溶液制備方法［3-6］后，均未得到理想檢測(cè)結(jié)果。查閱文獻(xiàn)［7］后得知，淫羊藿中存在齊墩果酸成分，與女貞子中的成分有重合，這可能是造成陰性干擾的原因之一。此項(xiàng)鑒別方法還有待進(jìn)一步深入研究，故未載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，僅通過(guò)薄層鑒別進(jìn)行產(chǎn)品的質(zhì)量控制，或僅以單種成分含量為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，均不能全面體現(xiàn)制劑的整體質(zhì)量情況，也不能對(duì)制劑的質(zhì)量進(jìn)行控制。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和分析技術(shù)的提升，中藥復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中絕大部分都加入了含量測(cè)定項(xiàng)，且由單一指標(biāo)性成分檢測(cè)向多組分檢測(cè)發(fā)展［8］。在芪貞增免顆粒中，黃芪甲苷、黃芪多糖、淫羊藿苷和特女貞苷分別為黃芪、淫羊藿和女貞子中的主要活性成分，對(duì)于疾病的治療也起到了主要作用，因此，本研究擬建立黃芪甲苷、黃芪多糖、特女貞苷和淫羊藿苷四種成分的含量測(cè)定方法。但在參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定黃芪多糖含量研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，陰性存在干擾，該方法專屬性較差。通過(guò)對(duì)輔料的篩選及制劑工藝的反復(fù)摸索試驗(yàn)，均未得到較好的結(jié)果，陰性依然存在干擾。分析原因，可能是輔料大部分為單糖、雙糖或多糖類成分所致。因此含量測(cè)定項(xiàng)未加入黃芪多糖的含量測(cè)定，下一步科研有待深入研究。

通過(guò)參考藥典及黃芪甲苷含量測(cè)定文獻(xiàn)［10-12］、淫羊藿苷和特女貞苷含量測(cè)定文獻(xiàn)［13-15］，本研究建立了HPLC-ELSD測(cè)定黃芪甲苷含量的方法，HPLC同時(shí)測(cè)定特女貞苷和淫羊藿苷含量的高效液相色譜法。對(duì)特女貞苷、淫羊藿苷對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，前者在224nm有最大吸收，后者在270nm有最大吸收，同文獻(xiàn)［15］結(jié)果一致，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm和270nm，采用波長(zhǎng)切換HPLC同時(shí)測(cè)定特女貞苷和淫羊藿苷的含量。

芪貞增免顆粒原有標(biāo)準(zhǔn)中僅有對(duì)黃芪和淫羊藿的薄層鑒別項(xiàng)，沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，原有標(biāo)準(zhǔn)不夠完善。為了建立一種準(zhǔn)確、可行且具備普遍適用性和規(guī)范性的芪貞增免顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，筆者進(jìn)行了較全面的試驗(yàn)研究，并依據(jù) 《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版Ⅳ部通則9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行了較細(xì)致的方法學(xué)驗(yàn)證，證明方法準(zhǔn)確可靠，專屬性高，可為芪貞增免顆粒制劑提供有效的質(zhì)量控制方法。黃芪甲苷、特女貞苷和淫羊藿苷含量測(cè)定方法的建立，提高了產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為芪貞增免顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，提供了參考依據(jù)。