鐵氰化鉀分光光度法測(cè)定頭孢氨芐

吳 珊

(新鄉(xiāng)學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

頭孢氨芐(cefalexin，CEX)是一種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素[1]，具有抗菌譜廣、無(wú)交叉耐藥性、低殘留、毒副作用小等特點(diǎn)，廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)界[2]。因此，對(duì)頭孢氨芐的測(cè)定研究具有重要的意義。目前，已報(bào)道的頭孢氨芐的測(cè)定方法有：微生物檢測(cè)法[3]、高效液相色譜法[4]、光化學(xué)熒光分析法[5]、旋光法[6]等。本文以鐵氰化鉀為探針利用分光光度法測(cè)定頭孢氨芐，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化測(cè)定條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

分別移取1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]和3.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3及3.00mL、1.096g/L的頭孢氨芐于50mL比色管中，用新煮沸冷卻的蒸餾水稀釋至刻度，搖勻于50℃下反應(yīng)40min，以試劑空白為參比，于700nm處測(cè)定吸光度A。

1.2 吸收光譜

通過(guò)測(cè)定吸收光譜可以得出，F(xiàn)e(III)在420nm時(shí)有較大吸收，而在700nm處無(wú)明顯吸收；普魯士藍(lán)的最大吸收波長(zhǎng)為700nm；空白試劑在700nm處有比較小的吸收，而頭孢氨芐在500～800nm范圍內(nèi)沒(méi)有吸收。為了消除其他試劑對(duì)吸光度的干擾，本實(shí)驗(yàn)以試劑空白為參比，測(cè)定700nm處生成物普魯士藍(lán)的吸光度而確定頭孢氨芐的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對(duì)吸光度的影響

2.1.1 三氯化鐵的量對(duì)吸光度的影響

固定其它條件不變：反應(yīng)溫度：20℃；反應(yīng)時(shí)間：30min；總體積：25mL。向七組比色管中均加入3.00mL、1.096g/L的頭孢氨芐，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]。

分別向七組比色管中加入不同量的1.5×10-2mol/L的FeCl3，用蒸餾水定容至25mL。在20°C下反應(yīng)40min，測(cè)得相應(yīng)的吸光度。通過(guò)檢測(cè)得出，吸光度隨著FeCl3用量的增加先增大而后減小。頭孢氨芐溶液和K3[Fe(CN)6]溶液中加入1.00mL的FeCl3(1.5×10-2mol/L)溶液時(shí)，吸光度達(dá)到最大為0.130。

2.1.2 鐵氰化鉀的量對(duì)吸光度的影響

固定其它條件不變：頭孢氨芐(1.096g/L) 3.00mL；FeCl3(0.015mol/L) 1.00mL；溫度：20℃；反應(yīng)時(shí)間：30 min；總體積：25mL，向九組比色管中均加入等量的頭孢氨芐， FeCl3溶液，再分別向九組比色管分別加入不同量的K3[Fe(CN)6]，用蒸餾水定容至25mL。結(jié)果表明，相應(yīng)的吸光度隨著K3[Fe(CN)6]的用量的增加先增大后減小。

2.1.3 溫度對(duì)吸光度的影響

固定其它條件不變，向八組比色管中均加入3.00mL、1.096mol/L的頭孢氨芐，1.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]。將八組比色管分別置于20～90℃的水浴鍋中40min，結(jié)果表明，吸光度隨著溫度的增大而增大。

2.1.4 時(shí)間對(duì)吸光度的影響

固定其它條件不變，向九組比色管中均加入3.00mL、1.096g/L的頭孢氨芐，1.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]，用蒸餾水定容至25mL。檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)在20℃下，隨著時(shí)間的推移，吸光度逐漸增大。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇三氯化鐵的量、鐵氰化鉀的量、反應(yīng)時(shí)間、溫度這四個(gè)因素為研究對(duì)象進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表1 因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

極差的大小順序?yàn)椋篟d>Ra>Rb>Rc，最優(yōu)方案為：A4B2C4D3。 從表中可以看出影響因素最大的是溫度，取加和最大的水平作為最佳條件。得出的最優(yōu)方案：3.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]，反應(yīng)時(shí)間40min、溫度為50℃。在最優(yōu)方案下，利用分光光度法對(duì)頭孢氨芐進(jìn)行測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

配制一系列頭孢氨芐的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以吸光度A與相應(yīng)的c進(jìn)行線(xiàn)性回歸。頭孢氨芐在80～160μg/mL范圍內(nèi)與A呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性回歸方程為A=0.03281+0.00749c(μg/mL)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R=0.9982。

圖1 頭孢氨芐溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 精密度檢測(cè)

平行測(cè)定12份試液，其吸光度A分別為0.708、0.708、0.710、0.710、0.711、0.710、0.710、0.710、0.711、0.710、0.709、0.710，由測(cè)得的A值得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為：δ = 9.57×10-4。

2.5 檢出限的測(cè)定

平行測(cè)定12份試劑空白試液：在比色管加入3.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]，用蒸餾水定容至25mL，測(cè)得A值分別為：0.643、0.643、0.642、0.642、0.642、0.643、0.643、0.642、0.642、0.642、0.642、0.641，標(biāo)準(zhǔn)偏差σ=5.95×10-4，計(jì)算檢出限為0.2384μg/mL。

2.6 樣品的制備與分析

2.6.1 頭孢氨芐樣品的分析

分別移取2.28 mL、2.74 mL、3.65 mL的頭孢氨芐溶液(1.096g/L)于3支25mL比色管中，依次向每支比色管加入3.00 mL FeCl3溶液、1.00 mL K3[Fe(CN)6]溶液，用蒸餾水定容后在50°C恒溫水浴中加熱40 min，然后對(duì)同一濃度的樣品平行測(cè)定3次，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(參比為不含藥品的空白試劑)，如表3。

2.6.2 牛奶樣品的制備及牛奶中頭孢氨芐的測(cè)定

分別移取1.00mL新鮮純牛奶至4個(gè)小燒杯中，再移取1.84mL、1.096g/L的頭孢氨芐溶液至1、2、3號(hào)燒杯，移取1.00mL、pH值=4.6的HAc-NaAc緩沖溶液至4個(gè)小燒杯，混合均勻后靜置10min。

對(duì)混合溶液進(jìn)行抽濾，將抽濾后的清液倒入25mL比色管中，再用緩沖液沖洗抽濾瓶，將沖洗液也倒入比色管中，分別移取0.46mL、0.86 mL、1.76mL的頭孢氨芐溶液(1.096g/L)于1、2、3號(hào)管中，再依次加入3.00mLFeCl3、1.00mLK3[Fe(CN)6]，用蒸餾水定容后在50°C恒溫水浴中加熱40min，以4號(hào)比色管為參比，對(duì)同一濃度的樣品平行測(cè)定3次，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表4。

表3 樣品及回收率的測(cè)定

表4 牛奶中樣品及回收率的測(cè)定

本文采用分光光度實(shí)驗(yàn)對(duì)頭孢氨芐進(jìn)行分析，在鐵氰化鉀存在條件下，頭孢氨芐可將三氯化鐵中的Fe(III)還原為Fe(II)，生成的Fe(II)與鐵氰化鉀反應(yīng)生成可溶性的普魯士藍(lán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此法可直接用于片劑頭孢氨芐含量的測(cè)定；同時(shí)，也可應(yīng)用于對(duì)牛奶中頭孢氨芐殘留的檢測(cè)，該方法的建立對(duì)實(shí)現(xiàn)牛奶質(zhì)量的監(jiān)測(cè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。