大氣顆粒物呼吸系統(tǒng)毒性效應(yīng)機(jī)制

趙云利，趙宇欣，何義勝，王元

（蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

環(huán)境污染，已成為影響人類健康的重大環(huán)境問題，引起了世界的廣泛關(guān)注。顆粒物是大氣污染的主要成分，也是環(huán)境污染危害人類健康的重要原因。流行病學(xué)調(diào)查和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)大氣顆粒物可以帶來諸如心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等多種健康危害，尤其是與哮喘、肺炎、呼吸道炎癥等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生高度相關(guān)。本文將大氣顆粒物對(duì)呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生危害的生理生化與分子機(jī)制進(jìn)行了綜述。

1 氧化應(yīng)激

氧化損傷通常被認(rèn)為是顆粒物毒性效應(yīng)的首要原因。當(dāng)呼吸系統(tǒng)遭受顆粒物的刺激時(shí)，呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化體系失衡，對(duì)細(xì)胞溶酶體、線粒體等細(xì)胞器產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致細(xì)胞的生理生化及代謝功能障礙，最終導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生或加重［1-3］。顆粒物致機(jī)體氧化-抗氧化體系失衡包含以下3個(gè)主要原因：顆粒物上附著的化學(xué)成分使得顆粒物本身具有自由基活性，如冬季燃燒顆粒物中的左旋葡聚糖、半乳聚糖和鉀等成分與其氧化能力緊密相關(guān)［4］；顆粒物的刺激致使肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ產(chǎn)生活性氧［1］；超氧化物歧化酶 SOD1、SOD2、過氧化氫酶（CAT）、過氧化還原酶6（PRDX6）等抗氧化酶活性改變［2］，細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）及c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路被激活［1］，機(jī)體抗氧化能力及氧化防御功能降低。

顆粒物暴露可以使人肺上皮細(xì)胞A549的SOD和CAT活性發(fā)生改變［5］，燃燒顆粒物可使大鼠抗氧化酶（SOD1、SOD2、CAT、PRDX6）和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的活性明顯上升［2］。PM2.5誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧可能作為信號(hào)分子，通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）激活氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)通路Nrf2來防御氧化應(yīng)激損傷［6］。PM2.5暴露促使Nrf2從細(xì)胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)AKT磷酸化和NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO-1）、血紅素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［6］。但PI3K抑制劑可以顯著下調(diào)PM2.5誘導(dǎo)的Nrf2核質(zhì)轉(zhuǎn)移及HO-1的轉(zhuǎn)錄水平［6］。顆粒物可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ產(chǎn)生活性氧，激活A(yù)SK1及JNK信號(hào)通路，增加肺泡-毛細(xì)血管屏障的通透性［1］。Song等［7］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA Let-7水平的顯著下調(diào)及其靶基因精氨酸酶2（ARG2）的表達(dá)上調(diào)是支氣管上皮細(xì)胞在PM2.5暴露后誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制。

2 炎癥反應(yīng)

顆粒物對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的炎癥刺激反應(yīng)可能是氧化應(yīng)激引發(fā)的后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［8］。顆粒物暴露可促進(jìn)肺泡及支氣管上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素 IL-6、IL-8、IL-Iβ 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子和細(xì)胞因子［9-11］，上調(diào)免疫活性因子NF-κB［12］，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤從而對(duì)呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生危害。這些炎癥因子與胞外基質(zhì)共同調(diào)節(jié)著顆粒物導(dǎo)致的組織修復(fù)和炎癥反應(yīng)［13］。

氣管滴注顆粒物后大鼠肺組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤和充血，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量增加；TNF-α、IL-1、IL-1β和細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）等炎癥介質(zhì)顯著上調(diào)，SOD和丙二醛（MDA）含量增加，同時(shí)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2A）、一氧化氮、細(xì)胞色素氧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等活性物質(zhì)的含量也明顯上升［9-11］。松木粉塵暴露還可引起大鼠肺泡灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及肥大細(xì)胞增多［14］。在氣管滴注顆粒物的小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果：博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠暴露于PM2.5中可導(dǎo)致肺組織炎性細(xì)胞浸潤程度明顯加重，肺泡間隔變寬，肺纖維化明顯加重，肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α水平顯著增高［15］；PM2.5暴露還可導(dǎo)致肺氣道黏膜嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)性增強(qiáng)，支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生，嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子增加，支氣管肺泡灌洗液中趨化因子增加，F(xiàn)4/80（+）CD11b（+）細(xì)胞增加，且CD206陽性的F4/80（+）CD11b（+）細(xì)胞（M2巨噬細(xì)胞）比例增加［16］。Ramanathan 等［17］在 PM2.5暴露的小鼠鼻腔灌洗液中觀察到血清白蛋白含量顯著增加，黏附分子Claudin-1和上皮鈣黏蛋白的表達(dá)下降，嗜酸細(xì)胞性炎癥因子IL-13和Eotaxin-1的表達(dá)上調(diào)，嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的明顯積聚。顆粒物暴露可顯著增加小鼠巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中炎癥因子（IL-1β、IL-8、TGF-β和環(huán)氧合酶-2）和氧化應(yīng)激基因（HO-1）的表達(dá)水平［18-19］，還可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［12］。

3 免疫反應(yīng)

顆粒物可對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用，提高機(jī)體特異性抗體水平，誘發(fā)哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病。研究顯示，柴油廢氣顆粒物可降低肺巨噬細(xì)胞的存活率，使機(jī)體免疫應(yīng)答水平降低［20］。顆粒物還可以導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及自然殺傷（NK）細(xì)胞減少，CD4/CD8比例下降，機(jī)體抵抗能力降低［21］。長期PM2.5暴露能引起小鼠輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）及相關(guān)細(xì)胞因子失衡，免疫功能下降［22］。PM2.5還可激活CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞清除的功能，刺激呼吸系統(tǒng)分泌機(jī)體蛋白［23］。

Toll樣受體（TLR）能識(shí)別外源化學(xué)物，啟動(dòng)天然免疫，在抗感染中發(fā)揮重要作用。大氣顆粒物可以激活TLR2和TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并作為NOD樣受體家族炎性小體（NLRP3）的有效激活劑促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［24］。Fuertes等［25］通過出生隊(duì)列研究分析揭示PM2.5濃度與過敏性鼻炎顯著相關(guān)，攜帶TLR4 rs1927911等位基因的兒童患過敏性鼻炎的風(fēng)險(xiǎn)增加。暴露于PM2.5的小鼠肺泡灌洗液中TLR4和TLR2的表達(dá)下調(diào)，NF-κB被激活，Th1/Th2偏移，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)Th2型免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥浸潤的產(chǎn)生［26-27］。

4 細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡

顆粒物誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基和炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化及胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，而Ca2+濃度的增加又導(dǎo)致更多活性氧的產(chǎn)生，加重機(jī)體的氧化應(yīng)激。顆粒物暴露大鼠肺泡灌洗液中堿性磷酸酶、表面活性物質(zhì)和上皮標(biāo)志酶活性增加，細(xì)胞膜通透性增加以致Ca2+內(nèi)流、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加［28］。支氣管上皮細(xì)胞的 Ca2+信號(hào)可被大氣顆粒物所介導(dǎo)，Ca2+通路抑制劑則可以減弱顆粒物誘導(dǎo)的Ca2+應(yīng)答［10］。對(duì)人肺成纖維細(xì)胞的研究也證實(shí)，顆粒物可通過磷脂酶阻斷劑、瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）M亞家族成員TRPM2抑制劑等調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性，改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)［29］。因此，當(dāng)給予細(xì)胞TRPM2阻滯劑克霉唑（CLZ）與鄰氨基苯甲酸（ACA）時(shí)，顆粒物所致細(xì)胞氧化應(yīng)激水平下降，細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)衰減［29］。細(xì)胞局部Ca2+濃度的增加，還可使細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T淋巴細(xì)胞核因子基因表達(dá)上調(diào)，誘發(fā)細(xì)胞免疫下降與凋亡［30］。

5 遺傳損傷

顆粒物可導(dǎo)致肺泡或支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，干擾肺組織細(xì)胞的核酸修復(fù)反應(yīng)，引起遺傳毒性和細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生或加重。研究發(fā)現(xiàn)顆粒物通過直接作用于修復(fù)蛋白抑制DNA修復(fù)、降低DNA復(fù)制的保真度，提高DNA復(fù)制錯(cuò)誤幾率和突變率［31］，使線粒體DNA拷貝數(shù)降低［3］，基因組DNA鏈斷裂［32］，微核增加［33］等途徑引起DNA表達(dá)、修復(fù)紊亂，最終導(dǎo)致遺傳損傷。彗星實(shí)驗(yàn)分析顯示顆粒物上粘附的多環(huán)芳烴（PAH）和羥基類還可以使V79和人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生移碼突變［34］。Mukherjee等［35］發(fā)現(xiàn)長期暴露于烹飪煙霧可以減少家庭主婦呼吸道上皮細(xì)胞的DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MMR）同源物mutL1（MLH1）和 mutS 2（MSH2）的表達(dá)，增加了DNA錯(cuò)配的可能。

除直接對(duì)DNA產(chǎn)生損傷外，顆粒物吸附的物質(zhì)還可以與DNA結(jié)合形成加合物，干擾DNA的正常功能。Rossner等［36］用P32標(biāo)記的方法對(duì)外周血淋巴細(xì)胞DNA加合物進(jìn)行檢測，結(jié)果提示空氣重污染地區(qū)顆粒物暴露人群的外周血苯并［a］芘（B［a］P）樣DNA加合物的水平均明顯升高。工業(yè)區(qū)大氣顆粒物可以引起肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生DNA加合物從而誘導(dǎo)肺癌的產(chǎn)生［37］。柴油機(jī)顆粒排放物上吸附的B［a］P和5-甲基青烯（5-MeCHR）等多環(huán)芳烴（PAH）能與DNA的親核位點(diǎn)鳥嘌呤外環(huán)氨基酸以共價(jià)鍵結(jié)合形成PAH-DNA加合物，引起DNA損傷［38］。

6 自噬

顆粒物可以被人支氣管上皮細(xì)胞所吞噬，被吞噬的顆粒形成自噬內(nèi)含體進(jìn)而形成自噬體，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，隨著顆粒物暴露濃度的增加和時(shí)間的延長，A549細(xì)胞微管蛋白輕鏈LC3的含量逐漸上升，表明顆粒物可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并且自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin1的表達(dá)明顯上調(diào)［5］。Xu 等［39］發(fā)現(xiàn)在人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B中，PM2.5暴露可以激活腫瘤蛋白P53，上調(diào)其下游靶基因DNA損傷自噬調(diào)節(jié)因子1（DRAM1）的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，進(jìn)而激活支氣管上皮細(xì)胞中的Src-STAT3通路介導(dǎo)VEGFA上調(diào)；此外，PM2.5暴露還可誘導(dǎo)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATR-CHEK1/CHK1（檢測點(diǎn)激酶1）軸的激活，進(jìn)一步引發(fā)P53依賴性自噬。自噬在顆粒物誘導(dǎo)的炎癥和黏液過度生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，沉默小鼠自噬相關(guān)基因Becn1或Lc3b可以降低顆粒物暴露導(dǎo)致的氣管分泌物的過度產(chǎn)生及炎癥的發(fā)生；而溶酶體抑制對(duì)自噬流的干擾可導(dǎo)致自噬體與自噬內(nèi)含體的積累，并加劇IL-8的產(chǎn)生，減弱氣道黏液蛋白（MUC5AC）的表達(dá)［40］。

7 表觀遺傳學(xué)改變

顆粒物暴露還可以導(dǎo)致甲基化、磷酸化、乙?；缺碛^遺傳學(xué)修飾，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響呼吸系統(tǒng)疾病。顆粒物水平與慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者NOS2A的DNA甲基化水平和呼吸道炎癥水平相關(guān)［41］。呼出氣一氧化氮（FeNO）是氣道炎癥生物標(biāo)志物，由氣道細(xì)胞產(chǎn)生，其濃度與炎癥細(xì)胞數(shù)目高度相關(guān)；FeNO水平又與NOS2A基因的甲基化水平密切相關(guān)［41］。De Prins等［42］以5-甲基-2'-脫氧胞苷的比例衡量人體全血DNA甲基化水平，研究結(jié)果提示成人DNA甲基化水平降低與環(huán)境PM2.5暴露水平相關(guān)。顆粒物暴露還可促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞中PI3K家族成員中的ATM、CHK2、組蛋白2A變異體（H2AX）磷酸化，導(dǎo)致DNA損傷，使端粒酶活性和miR-21表達(dá)上調(diào)，芳烴受體（AhR）調(diào)節(jié)基因（CYP1A1、CYP1B1、AhRR）的表達(dá)增加［32，43］。

組蛋白3第27位賴氨酸乙?；℉3K27ac）是參與免疫細(xì)胞活化的標(biāo)記基因，H3K27ac的乙酰化水平與空氣污染引起的免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)，Liu等［44］通過染色質(zhì)免疫共沉淀與二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，顆粒物暴露可以導(dǎo)致H3K27ac的乙?；癄顟B(tài)發(fā)生變化。組蛋白去乙?；?（HDAC3）是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子，為炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)所必需，PM2.5通過激活TGF-β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)WT小鼠的肺功能損傷與炎癥反應(yīng)；HDAC3缺陷可促進(jìn)PM2.5誘導(dǎo)的TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活［27］。

8 基因表達(dá)調(diào)控

顆粒物暴露可以改變促炎癥反應(yīng)過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及癌癥和發(fā)育途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，共同應(yīng)對(duì)來自外界的刺激。轉(zhuǎn)錄因子AP-1是細(xì)胞內(nèi)由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體，通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來應(yīng)對(duì)多種刺激，氣管滴注高濃度顆粒物，大鼠肺組織c-fos和c-jun的表達(dá)顯著增高［9］，AP-1 的活性增強(qiáng)［40］。Libalova 等［45］對(duì)PM2.5暴露的A549細(xì)胞的基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，PM2.5暴露可導(dǎo)致促炎癥反應(yīng)過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及癌癥和發(fā)育途徑中TGF-β和Wnt信號(hào)通路等相關(guān)基因的表達(dá)紊亂，但涉及細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)或細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)則沒有發(fā)現(xiàn)異常。通過人胚肺成纖維細(xì)胞基因芯片分析顯示ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（參與外源性和內(nèi)源性代謝物跨膜轉(zhuǎn)移和DNA修復(fù)），Wnt和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑（特別與腫瘤促進(jìn)和進(jìn)展相關(guān)），類固醇激素生物合成（參與化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾活性）和甘油脂代謝（包括脂質(zhì)與脂質(zhì)信號(hào)分子的甘油骨架的脂質(zhì)途徑）相關(guān)基因表達(dá)明顯失調(diào)［46］。

9 細(xì)胞周期的改變

顆粒物通過DNA結(jié)合、線粒體和紡錘體等的損害引起染色體的過早濃縮，從而導(dǎo)致人類支氣管上皮細(xì)胞有絲分裂受阻，細(xì)胞增殖受到抑制，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［32］。顆粒物還可以通過長鏈非編碼RNA（lncRNA）LINC0034調(diào)節(jié)P21蛋白的表達(dá)，使支氣管上皮細(xì)胞周期阻滯于G2/M期［47］。

此外，顆粒物還可降低機(jī)體對(duì)其它有害因素的抵抗力。如呼吸道表面的液體含有大量的抗菌蛋白和抗菌肽，而PM2.5與抗菌蛋白和抗菌肽的結(jié)合可以減弱其抗菌活性，使機(jī)體更容易受到病毒和細(xì)菌的侵害［48］。

呼吸系統(tǒng)疾病是大氣顆粒物對(duì)人體的主要危害之一，研究證實(shí)氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答、基因表達(dá)與調(diào)控等生理生化過程均參與對(duì)顆粒物的防御過程［49］。深入了解顆粒物對(duì)機(jī)體呼吸系統(tǒng)損傷的機(jī)制有助于我們預(yù)防顆粒物產(chǎn)生的呼吸系統(tǒng)危害，探索防治大氣顆粒物危害的有效方法和技術(shù)。