UPLC-MS/MS同時(shí)測定菟絲子中6種黃酮類成分的含量

張威，付之恬，劉宸光，王博倫，劉潤東，范榮華

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級，遼寧 沈陽 110034；2.藥學(xué)專業(yè)2017級；3.預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2014級；4.衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室）

傳統(tǒng)中藥菟絲子為旋花科植物菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟種子。傳統(tǒng)用于陽痿遺精、尿有余瀝、遺尿尿頻、腰膝酸軟、目昏耳鳴、腎虛胎漏、胎動不安、脾腎虛瀉，外治白癜風(fēng)等［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菟絲子具有壯陽、提高垂體對促性腺激素釋放激素（LRH）及卵巢對促黃體生成素（LH）反應(yīng)性、降壓、增強(qiáng)心臟收縮力、延緩白內(nèi)障形成等作用［2-4］。

菟絲子主要包含黃酮類、糖苷酸類、木脂素類與多糖類成分［5-8］。其中黃酮類化合物為菟絲子的主要活性成分，主要有紫云英苷、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素等［9］。藥理研究表明，菟絲子黃酮類成分具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫、促進(jìn)成骨細(xì)胞活性、保護(hù)血管與調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用［10-12］。其中的槲皮苷具有抗氧化清除自由基、鎮(zhèn)靜催眠、抗動脈粥樣硬化［13-15］等多種生物學(xué)活性，槲皮素對去甲腎上腺促人血管平滑肌細(xì)胞增殖有抑制作用［16］。由此可見，對菟絲子中黃酮類成分進(jìn)行質(zhì)量控制對其合理應(yīng)用具有重要意義。目前對紫云英苷、金絲桃苷等黃酮類成分的檢測主要包括高效液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但檢測時(shí)間較長，靈敏度不高。因此，本文建立了菟絲子中的6種黃酮類成分含量的高效快速的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），檢測快速、靈敏度高，將為菟絲子中藥材的質(zhì)量控制提供方法依據(jù)。同時(shí)我省是菟絲子藥材的主產(chǎn)地，隨著近年來不斷發(fā)掘的菟絲子新的藥理活性，建立準(zhǔn)確、高效的菟絲子質(zhì)量評價(jià)方法，使得我省對提高菟絲子的安全性評價(jià)研究方法水平，進(jìn)一步優(yōu)化菟絲子品種，促進(jìn)菟絲子的臨床合理應(yīng)用具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；萬分之一天平（德國Sartorius公司，BSA124S）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200DV）；電子數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；旋渦混合器（SilentShake，HYQ-2121A）；高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，HC-2062）。

1.2 材料 金絲桃苷（Hyperoside）、紫云英苷（Astragalin）、異槲皮苷（Isoquercitrin）、槲皮苷（Quercitrin）、山萘酚（Kaempferol）購自中國食品藥品檢定研究所；槲皮素（Quercetin，自制，HPLC歸一化法測得質(zhì)量濃度大于98%），同時(shí)通過核磁共振和質(zhì)譜數(shù)據(jù)確證為槲皮素單體成分。菟絲子購買于沈陽市天益堂大藥房。甲醇、甲酸（美國Sigma公司，HPLC級），實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描模式下多反應(yīng)離子檢測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為150℃，脫溶劑溫度為400℃，脫溶劑氣流量為700 L/h，錐孔氣流量為50 L/h；碰撞氣為氬氣，壓力為2.95×10-3mbar；準(zhǔn)確質(zhì)量校正采用NaCsI進(jìn)行校正。

各化合物根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定待測物的定量參數(shù)見表1，二級質(zhì)譜圖見圖1。

表1 6種黃酮類成分的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 6種黃酮類成分的二級質(zhì)譜圖

2.2 色譜條件 色譜柱：Waters UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A相：甲醇；B相：0.1%甲酸-水。梯度洗脫程序：0～5 min：55%B～20%B；5～5.01 min：20%B～55%B；5.01～6.5 min：55%B，流速：0.3 ml/min。進(jìn)樣量：5 μl；柱溫：30℃。各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)測得成分峰計(jì)算均不低于3 000。

2.3 對照溶液的制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml分別含各對照品0.5 mg的混合儲備液Ⅰ。精密量取混合儲備液1.0 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合5μg/ml對照溶液Ⅱ。

2.4 供試溶液的制備 將菟絲子種子粉碎，取粉末約1.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入水25 ml，稱定重量，浸泡過夜，振搖混勻，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，渦旋混勻，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液5μl，UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取混合儲備液Ⅱ制成濃度為 5、10、50、100、250、500 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別UPLC-MS/MS自動進(jìn)樣5μl，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果表明，各化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表2。

表2 6種黃酮類成分的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.6 精密度試驗(yàn) UPLC-MS/MS自動進(jìn)樣對照溶液5μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，讀取各色譜峰峰面積，得到6種黃酮化合物的峰面積RSD%分別 為 1.3%、0.8%、1.4%、0.9%、1.2%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取菟絲子藥材粉末，按“2.4供試溶液的制備”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣UPLC-MS/MS，記錄色譜圖，讀取各色譜峰峰面積，計(jì)算6種黃酮化合物含量的RSD%分別為1.5%、1.8%、1.7%、1.6%、1.9%、1.4%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4供試溶液的制備”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣，記錄色譜圖，讀取各色譜峰峰面積，6種黃酮化合物峰面積的RSD%分別為1.2%、1.1%、1.2%、1.4%、1.3%、1.2%，結(jié)果表明供試溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知量的菟絲子樣品（產(chǎn)地：遼寧沈陽）9份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入對照品溶液0.5、1.0、2.0 ml，每個(gè)樣品平行3份，按“2.4供試溶液的制備”項(xiàng)下的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算6種黃酮化合物的含量，計(jì)算加樣回收率，各化合物的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為95.8%、98.2%、94.9%、97.1%、95.1%和95.7%（RSD分別為2.1%、2.2%、2.5%、2.4%、2.7%和2.2%）。

2.10 樣品測定 取不同批次的菟絲子樣品（產(chǎn)地：遼寧沈陽），按“2.4供試溶液的制備”項(xiàng)下的方法操作，UPLC-MS/MS自動進(jìn)樣供試溶液5μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇 對待測物質(zhì)6種黃酮化合物成分進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6種黃酮類化合物在正負(fù)離子監(jiān)測下都能測定，但是在負(fù)離子條件下檢測響應(yīng)強(qiáng)于正離子條件，因此選擇負(fù)離子反應(yīng)監(jiān)測。

3.2 液相條件的選擇 為了獲得更好色譜峰峰形，保留時(shí)間和靈敏度，分別對甲醇-水、乙腈-水的等度與梯度條件進(jìn)行考察，結(jié)果表明以甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)色譜峰峰形好，響應(yīng)高，背景噪音小，同時(shí)加入甲酸到水相系統(tǒng)中可以使色譜峰峰形對稱性得到提高，通過考察不同含量的甲酸（0.1%、0.2%、0.3%、0.5%），最終確定液相系統(tǒng)為甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫，可達(dá)到理想的分離度。

表3 6種黃酮類成分的樣品含量（n=3，×10-3mg/g）

因此本研究采用高效靈敏的UPLC-MS/MS技術(shù)對不同批次的菟絲子中6種黃酮類化合物成分進(jìn)行了含量測定，該研究方法將為菟絲子中藥材的質(zhì)量控制提供方法依據(jù)，對提高菟絲子的臨床合理應(yīng)用具有重要作用。