多種方法診斷狂犬病

于 淼

（遼寧省朝陽市畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 朝陽 122000）

狂犬病又稱恐水病，是人畜及野生動(dòng)物共患的二類動(dòng)物傳染病，幾乎所有的溫血?jiǎng)游锞赘?。本病的?chǔ)毒宿主復(fù)雜多樣，給防控檢疫帶來諸多困難，以致本病仍在少數(shù)地區(qū)發(fā)生和流行，有些地區(qū)甚至還有回升趨勢，常見一些病例見諸各大媒體報(bào)端。因其病死率為100%，危害極為嚴(yán)重，所以對(duì)其檢疫和防控不容忽視。

1 病原介紹

病原體是狂犬病病毒（RV），犬和貓科動(dòng)物、包括某些嚙齒類動(dòng)物以及蝙蝠等野生動(dòng)物是病原的自然宿主，長期帶毒。人和家畜感染的主要傳染源是病犬或病貓。被患病動(dòng)物咬傷是最常見的傳播方式，損傷的皮膚黏膜被含有狂犬病病毒的唾液污染也可引起感染。多呈散發(fā)，連鎖明顯，即一個(gè)接一個(gè)地傳染。染病動(dòng)物狂暴不安，意識(shí)障礙，有主動(dòng)攻擊人畜行為，最后呈局部或全身麻痹而亡，病死率100%。

發(fā)病或帶毒動(dòng)物是本病的主要傳染源，為此，及時(shí)確診對(duì)本病的防控十分重要。

2 病原學(xué)診斷方法

電鏡觀察：取被檢動(dòng)物的新鮮腦組織制成電鏡負(fù)染標(biāo)本或超薄切片，進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)本病毒即可確診。由于所觀察的樣品有限，即使未檢出RV，也不能否定本病。

病毒分離鑒定：用2%健康犢牛血清制成鹽水，將被檢的腦、睡液等樣品制成無菌乳劑，腦內(nèi)接種5～7 日齡的小鼠或1～1.2 kg的健康幼兔，隔離飼養(yǎng)，盲傳3代。如分離鑒定出RV則可確診。

熒光抗體染色：通常采用阻斷對(duì)比法，生前用玻片壓印眼球，制成角膜壓印片，死后取海馬回等腦組織，制備壓印片2 張，固定后，分別用經(jīng)健康和死于狂犬病病毒感染鼠腦吸收的狂犬病毒熒光抗體染色，如僅在以健康鼠腦吸收的熒光抗體染色標(biāo)本中檢出特異性熒光細(xì)胞，則可診斷為本病。此法狂犬病犬腦的陽性檢出率可達(dá)95%，實(shí)驗(yàn)感染小鼠角膜狂犬病病毒犬陽性檢出率也達(dá)95%，與唾液腺的病毒出現(xiàn)相一致。

酶標(biāo)抗體染色法：應(yīng)用以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗RV 特異抗體代替熒光抗體進(jìn)行上述標(biāo)本的免疫酶染色，在普通顯微鏡下，觀察被檢細(xì)胞漿內(nèi)有無棕褐色顆?；驂K，同樣可以定論診斷。

病毒核酸檢查法：用事先制備的與RV某段基因互補(bǔ)的核酸引物或探針，通過對(duì)樣品的RV核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)和原位雜交試驗(yàn)，檢查實(shí)驗(yàn)感染的鼠腦其敏感性與特異性與ELISA法相近。

包涵體檢查：此法最為簡便，即用海馬回等腦組織制成壓印片，立即用Seller 液染色、鏡檢，如在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)檢出嗜酸性的內(nèi)基氏小體，也可以確診。需要注意的是要與有可能出現(xiàn)的犬瘟熱性包涵體以及腦中存在的非特異包涵體樣物質(zhì)相區(qū)別。但檢不出包涵體不能排除狂犬病的可能。因狂犬病犬腦的包涵體檢出率只有70%～90%。

3 血清學(xué)診斷方法

用事先制備好的RV抗原，應(yīng)用此法檢查被檢血清有無相應(yīng)的抗體存在，主要用于本病的免疫力監(jiān)測，回顧性診斷與流行病學(xué)調(diào)查。

3.1 中和試驗(yàn)

這是最常用也最重要的一種檢測技術(shù)，至今許多新的檢測技術(shù)仍以此為參照。中和抗體針對(duì)的是決定毒力的糖蛋白抗原，所以中和抗體的滴度，直接反應(yīng)機(jī)體對(duì)RV的免疫能力，因而常被用作人畜狂犬病免疫力監(jiān)測，狂犬疫苗評(píng)價(jià)和RV的血清型鑒定。

最常采用的術(shù)式是固定病毒稀釋血清法，被檢血清經(jīng)稀釋后，作一定倍數(shù)的連續(xù)稀釋，各加等量200LD50的RV 固定毒CVS株，37 ℃水浴作用1h后，分別腦內(nèi)接種12～13 g重的小白鼠，每個(gè)稀釋度6只，然后根據(jù)各稀釋度血清的小鼠死亡與存活數(shù)按Reed—Muench計(jì)算該待檢血清的50%中和效價(jià)。

中和抗體出現(xiàn)較早，感染1周后即開始出現(xiàn)，3～4周后達(dá)最高峰，并可持續(xù)1～1.5年。因此通過雙份血清的中和抗體檢查，還有可能檢出帶毒的頓挫型感染病例。通過小鼠的交叉保護(hù)試驗(yàn)或細(xì)胞培養(yǎng)物的病變抑制試驗(yàn)，則可用于病毒的鑒定與型的分析。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

具有高度的敏感性和特異性，常被用于狂犬病抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物及病料中RV抗原的檢測。檢測抗體時(shí)多采用間接法，即先用提純的RV預(yù)先包被聚苯乙烯微量滴定板，與不同稀釋的被檢血清感作、洗滌后，再加酶標(biāo)的第二抗體，最后再加底物顯色，結(jié)果呈現(xiàn)良好。李金中對(duì)包被法進(jìn)行了改良，先用兔抗RVIgG包被，再加RV感染的小鼠腦懸液或細(xì)胞培養(yǎng)物，通過IgG 將RV 吸附到板上，免去RV濃縮提純的步驟，效果同樣良好。

檢測RV 抗原時(shí)，采用夾心間接法，即先用倉鼠抗RVIgG 包被，隨后加入被檢腦組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，沖洗后再依次加兔抗RV抗體和酶標(biāo)驢抗兔IgG，最后加底物顯色判定，結(jié)果也很滿意。

4 防治措施

平時(shí)加強(qiáng)對(duì)犬和貓的管理，對(duì)家犬進(jìn)行定期免疫接種和徹底消滅鼠類是預(yù)防人和動(dòng)物狂犬病的有效措施。發(fā)現(xiàn)病犬及其他患病動(dòng)物應(yīng)立即捕殺，尸體深埋或焚燒。被咬傷動(dòng)物的傷口應(yīng)及時(shí)處理，先用20%肥皂水沖洗，再用2%～3%碘酊消毒，同時(shí)注射狂犬病疫苗，可免于發(fā)病。