半微量蒸餾法測定飼料中粗蛋白質(zhì)含量要點(diǎn)

田 蘊(yùn)，王益軍，葛 敏，賀 燕，張?zhí)K珍，徐顥瑋，陶 威

（連云港市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，江蘇 連云港 222001）

蛋白質(zhì)由多種氨基酸組成，是構(gòu)成細(xì)胞、血液、骨骼、肌肉、乳、毛及各種器官組織的主要成分，對(duì)生長、發(fā)育、繁殖及各器官的修補(bǔ)都是必需的，是生命活動(dòng)必需的基礎(chǔ)養(yǎng)分。粗蛋白質(zhì)是含氮物質(zhì)的總稱，包括真蛋白質(zhì)和含氮物，粗蛋白質(zhì)是鑒定飼料質(zhì)量時(shí)必檢的常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)之一，國標(biāo)GB/T 6432-1994 中采用的是凱氏定氮法，該標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料和單一飼料，其原理是樣品在催化劑作用下，用濃硫酸破壞有機(jī)物，使含氮物轉(zhuǎn)化為硫酸銨，然后加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾，使氨逸出，用硼酸吸收后再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，測出氮含量，從而計(jì)算出樣品中粗蛋白質(zhì)的含量[1-4]。其操作程序比較復(fù)雜，影響因素很多，本文結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)以半微量蒸餾法為例，從取樣開始，對(duì)每個(gè)過程進(jìn)行詳細(xì)解析，指出關(guān)鍵影響因素及解決辦法，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 試樣的選取和制備

1.1 要求

選取有代表性的試樣用四分法縮減至200 g，粉碎后全部通過40目篩，裝于密封容器中，防止試樣成分的變化。

1.2 影響因素

1.2.1 采樣人員

采樣應(yīng)該由受過適當(dāng)培訓(xùn)并有飼料采樣經(jīng)驗(yàn)的人員執(zhí)行，采樣應(yīng)做到隨機(jī)、客觀，避免人為和主觀因素的影響，代表性采樣的目的是從一批產(chǎn)品中獲得小部分樣品，而測定這小部分樣品的任何特性均可代表該批產(chǎn)品的平均值。

1.2.2 樣品量

要得到能代表整個(gè)批次產(chǎn)品的樣品，就必須設(shè)置足夠的分樣數(shù)量，根據(jù)批次產(chǎn)品數(shù)量和實(shí)際采樣的特點(diǎn)確定需采的份樣數(shù)量和重量，重量應(yīng)≥2 kg。

1.2.3 分樣

將各個(gè)取樣點(diǎn)采集的樣品置于干凈、平整的鐵板上，堆成圓錐形，用干凈的樣鏟將樣品轉(zhuǎn)堆混勻；轉(zhuǎn)堆操作時(shí)，樣品不得從樣鏟側(cè)面下落，必須做到樣品自圓錐頂尖落下，均勻地沿錐尖散落，注意不能使圓錐頂尖錯(cuò)位；如此反復(fù)轉(zhuǎn)堆3次，使試樣充分混勻，然后把圓錐頂尖壓平，用樣鏟自上壓下，把樣品分成大致相等的4 個(gè)等分，取任意兩個(gè)對(duì)角的等分，其余舍棄，重復(fù)操作至得到規(guī)定的樣品量。

1.2.4 樣品粉碎

一般飼料的樣品顆粒較大，成分復(fù)雜，檢測時(shí)稱樣量小，如果細(xì)度不夠，容易造成稱樣時(shí)樣品不均勻，從而引起檢測結(jié)果的誤差。過篩時(shí)，要注意把粉碎的試樣及粉碎機(jī)中殘留的部分清掃后充分混勻過篩；同時(shí)還要注意，在粉碎或過篩過程中有些樣品容易產(chǎn)生自動(dòng)分級(jí)，如玉米，其硬質(zhì)部分常聚集在上面，軟質(zhì)部分聚在下面，因此粉碎過篩后要重新混合均勻，以減少測量誤差[5]。

1.2.5 樣品保存

過篩后的樣品，要根據(jù)樣品的特性選擇合適的容器密封保存。

2 稱 樣

2.1 要求

國標(biāo)中規(guī)定稱樣量為0.5～1 g（精確到0.000 1 g）。

2.2 影響因素

2.2.1 稱樣的準(zhǔn)確性

用分析天平準(zhǔn)確稱取試樣，精確到0.000 1 g，一式兩份做平行樣。

2.2.2 稱樣量大小

稱取樣品的數(shù)量要合適，不能太多也不能太少，一般飼料的稱樣量為0.5 g，粗蛋白質(zhì)含量≤10%時(shí)，稱樣量＞0.5 g，這樣可以避免在滴定時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積過小，減小誤差，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 消 煮

3.1 要求

稱取試樣后，加入混合催化劑6.4 g，與試樣混合均勻，再加入硫酸12 mL 和玻璃珠2 粒，置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化，泡沫消失后，再加強(qiáng)火力（360～410 ℃）直到呈透明的藍(lán)綠色，然后再繼續(xù)加熱，至少2 h。消化過程發(fā)生以下化學(xué)反應(yīng)：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O。

3.2 影響因素

3.2.1 催化劑

催化劑的作用是提高硫酸的沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解。催化劑用量減小，則有機(jī)物分解速度緩慢，消化容易不完全；催化劑用量加大，易引起消煮液結(jié)晶，造成氮的損失。

3.2.2 硫酸

濃硫酸的作用是對(duì)樣品進(jìn)行脫水及碳化。濃硫酸加量不足，容易出現(xiàn)燒干現(xiàn)象，標(biāo)準(zhǔn)中的硫酸用量，可滿足大部分樣品的消解，對(duì)于體積大、重量輕的粗飼料、高蛋白飼料或含水量較高的試樣，應(yīng)適當(dāng)加大濃硫酸用量，約15 mL，但要注意在后續(xù)蒸餾步驟，氫氧化鈉的用量也要相應(yīng)調(diào)整[6]。

3.2.3 消化溫度和速度

消化時(shí)速度要緩慢，如果升溫過快，則部分含氮物質(zhì)來不及轉(zhuǎn)化成硫酸銨，而以氣體形式損失掉，會(huì)造成檢測結(jié)果偏低。開始時(shí)小火（200～300 ℃）加熱，目的是防止沸騰的液體溢出瓶口或?qū)⑻蓟蟮暮谏w粒濺到瓶壁上，導(dǎo)致消化不完全，引起結(jié)果偏低，在消化過程中可以小心輕搖液體將黑色顆粒沖到瓶底的硫酸溶液中（小心防燙），以避免消化不完全。

3.2.4 消解時(shí)間

消解時(shí)間對(duì)飼料中粗蛋白測定結(jié)果影響很大，消解時(shí)間太短，消化不完全，消解時(shí)間過長，又會(huì)造成氨的損失，都會(huì)造成結(jié)果偏低，通常一般樣品在消煮液變綠后至少再消化2 h。

4 消煮液的轉(zhuǎn)移

4.1 要求

將試樣消煮液冷卻，加入蒸餾水20 mL，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。

4.2 影響因素

4.2.1 消煮液冷卻時(shí)間

一般是等冷卻至不燙手時(shí)再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，冷卻溫度不夠時(shí)，加入蒸餾水，與熱硫酸發(fā)生劇烈反應(yīng)，易引起燙傷；冷卻時(shí)間太長，則消煮液容易結(jié)晶，如果出現(xiàn)結(jié)晶，可放于電爐上加熱溶解，或放在50 ℃水浴中超聲溶解[7]。也可定容至200 mL 容量瓶中，計(jì)算結(jié)果時(shí)試樣分解液總體積以200 mL計(jì)，不影響測定結(jié)果[8]。

4.2.2 轉(zhuǎn)移方法

為了防止消煮液損失，可以在容量瓶上加上漏斗，并用玻璃棒引流，小心地將凱氏燒瓶里的液體轉(zhuǎn)移至容量瓶中，并按照少量多次原則，用少量蒸餾水多次洗滌燒瓶，全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，轉(zhuǎn)移不完全會(huì)造成結(jié)果偏低。

4.2.3 定容

由于硫酸與水反應(yīng)會(huì)放熱，一定要等到容量瓶中液體冷卻至室溫后再定容，否則會(huì)引起定容體積不準(zhǔn)確，造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

5 蒸 餾

蒸餾過程發(fā)生如下化學(xué)反應(yīng)：2NaOH+（NH4）2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O。

5.1 要求

將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20 mL 硼酸吸收液和2 滴混合指示劑（甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑）的錐形瓶中，蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則應(yīng)補(bǔ)加硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液10～20 mL 注入蒸餾裝置的反應(yīng)室中，用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10 mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4 min 降下錐形瓶，使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1 min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗滌液均流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。

5.2 影響因素

5.2.1 冷凝水

冷凝水要在蒸餾開始前開啟，冷卻不完全，易造成結(jié)果偏低。

5.2.2 系統(tǒng)密閉性

蒸餾過程中，要求整套裝置呈密閉狀態(tài)，不能漏氣，否則易造成氨氣逸出，影響檢測結(jié)果。一般要注意以下幾點(diǎn)：蒸餾前應(yīng)檢查定氮儀各導(dǎo)管間的連接處是否密閉并用硫酸銨進(jìn)行檢驗(yàn)；往蒸餾室加樣液之前要把冷凝管末端浸入硼酸吸收液液面以下；樣液加入蒸餾裝置后，要及時(shí)水封；加堿液時(shí)，堿液尚未流完時(shí)，加適量蒸餾水沖洗，并留下少量蒸餾水作水封；整個(gè)反應(yīng)室除了冷凝管路浸在吸收液里，其余管路都保持密封，防止漏氣；防止生成的氨氣揮發(fā)[9-10]。

5.2.3 蒸汽中氮元素的控制

為了防止水中的氮元素隨著水蒸汽揮發(fā)出來，影響測定結(jié)果，在蒸汽發(fā)生器里加硫酸，使水中的氮元素轉(zhuǎn)化成硫酸銨[11-12]。

5.2.4 蒸汽量大小

蒸汽量太大，反應(yīng)室的液體易沖進(jìn)冷凝管內(nèi)，引起結(jié)果偏高；蒸汽量太小，蒸餾速度慢，容易發(fā)生倒吸，引起結(jié)果偏低。

5.2.5 反應(yīng)室溶液體積

在沖洗加樣時(shí)用水量要少，否則反應(yīng)室溶液體積太大，液面升高，反應(yīng)室的液體容易沖進(jìn)冷凝管內(nèi)，引起結(jié)果偏高。

5.2.6 蒸餾時(shí)間

蒸餾時(shí)間不夠，氨氣未完全蒸餾出來，蛋白質(zhì)含量偏低；蒸餾時(shí)間過長，則會(huì)造成時(shí)間和資源的浪費(fèi)，如果樣品含氮量特別高，可以適當(dāng)延長蒸餾時(shí)間。

5.2.7 清洗

每次蒸餾完畢后應(yīng)先取下接收瓶，再進(jìn)行清洗，必須徹底清洗蒸餾室，以免再次使用時(shí)影響測定結(jié)果。

6 滴 定

6.1 要求

蒸餾后的吸收液立即用0.1 或0.02 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測定，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。滴定過程發(fā)生如下化學(xué)反應(yīng)：NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3

6.2 影響因素

6.2.1 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)溶液要按照GB/T 601 配制并標(biāo)定，在使用前應(yīng)搖勻。

6.2.2 滴定過程

滴定前要注意排除滴定管底部的氣泡，過程中要邊滴定邊搖動(dòng)錐形瓶，防止來不及反應(yīng)，滴定速度保持6～8 mL·min-1，和標(biāo)定時(shí)的滴定速度保持一致。

6.2.3 測定終點(diǎn)的判定

甲基紅-溴甲酚綠指示劑變色范圍為pH 5.0～5.2，pH＜5.0 為暗紅色，pH 5.1 為灰綠色，pH＞5.2為綠色，滴定接近終點(diǎn)時(shí)要緩慢加入，仔細(xì)觀察溶液顏色的變化，液體顏色變?yōu)闊o色時(shí)接近滴定終點(diǎn)，然后再半滴半滴加入，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)，保持顏色變化和空白測定顏色一致。

7 空白測定

空白檢測的目的是校正所用試劑帶來的誤差。

7.1 要求

稱取蔗糖0.5 g，代替試樣，按照樣品測定步驟同法操作，消耗0.1 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積≤0.2 mL，消耗0.02 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積≤0.3 mL。一般做一組平行進(jìn)行檢測，這樣可以減小試驗(yàn)測定值與真實(shí)值之間的誤差，同時(shí)也可以衡量整個(gè)試驗(yàn)操作過程是否正確。

7.2 影響因素

蔗糖是一種有機(jī)物，但是又不含氮，所以能被用來代替樣品測試空白，空白樣品滴定消耗鹽酸的量以0.05～0.15 mL為宜，空白值過高的一般是由蒸餾水的純度不夠、所用試劑的純度不夠及所用器皿清潔度不夠等原因造成。

8 蒸餾步驟的檢驗(yàn)

8.1 要求

精確稱取0.2 g 硫酸銨代替試樣按照蒸餾步驟進(jìn)行操作，測得硫酸銨含氮量為21.19±0.2%，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

8.2 影響因素

在保證加堿、蒸餾和滴定步驟操作正確的前提下，系統(tǒng)的氣密性是關(guān)鍵影響因素，因此硫酸銨的測定目的通常是為了檢查半微量蒸餾裝置的氣密性。

9 結(jié)果計(jì)算

先測出飼料中的含氮量，再根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量計(jì)算出粗蛋白質(zhì)的含量，由于一般蛋白質(zhì)中含氮量約為16%，所以一般用系數(shù)6.25 作為氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。如果飼料中的含氮量已經(jīng)確定，可用實(shí)際系數(shù)來換算，例如蕎麥、玉米用系數(shù)6.00，大豆、小麥用系數(shù)5.70[5]。