光學(xué)生物傳感器在抗生素殘留檢測(cè)中的研究進(jìn)展

袁曉春

（錦州市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 錦州 121000）

抗生素主要由微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工合成的類(lèi)似物，目前抗生素的種類(lèi)達(dá)到上萬(wàn)種，主要包括磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、多肽類(lèi)等。抗生素在抑制或殺滅病原微生物方面發(fā)揮著重要的作用，已在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用于治療預(yù)防疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，且使用量大，據(jù)報(bào)道中國(guó)每年有成千上萬(wàn)噸的抗生素在畜牧業(yè)中使用。然而大部分抗生素不能直接被動(dòng)物體吸收，主要以藥物原形直接進(jìn)行生態(tài)環(huán)境中且不易降解，所以亂用濫用抗生素，易造成抗生素的嚴(yán)重殘留，并且通過(guò)食物鏈傳遞對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康造成潛在的危害[1-3]。因此，為了監(jiān)控抗生素殘留問(wèn)題，保障環(huán)境和人類(lèi)健康，對(duì)抗生素的殘留檢測(cè)非常重要。檢測(cè)抗生素殘留的常用方法主要有三大類(lèi)：微生物檢測(cè)法、免疫學(xué)分析法以及理化分析檢測(cè)法，如管碟法紙片法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法等，但是這些方法各有優(yōu)劣。近年來(lái)研究建立的生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，在抗生素殘留檢測(cè)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[2,4-6]。

生物傳感器是一種多學(xué)科交叉滲透發(fā)展起來(lái)的高新技術(shù)裝置，由生物感應(yīng)元件和信號(hào)處理元件組成，生物感應(yīng)元件可以與檢測(cè)目標(biāo)物相互作用產(chǎn)生一定的響應(yīng)信號(hào)，信號(hào)處理元件對(duì)響應(yīng)的信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換并輸出，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)[7]。根據(jù)響應(yīng)信號(hào)的不同，生物傳感器可分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器等。本文將對(duì)光學(xué)生物傳感器在抗生素殘留檢測(cè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為抗生素殘留檢測(cè)方法的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

光學(xué)生物傳感器是以抗體、酶、適配體等生物材料為感應(yīng)元件，以光信號(hào)為檢測(cè)對(duì)象的一類(lèi)生物傳感器，因?yàn)榫哂胁僮骱?jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高和響應(yīng)速度快等特點(diǎn)，已被用于食品中抗生素殘留檢測(cè)領(lǐng)域，且最低檢測(cè)限遠(yuǎn)低于最大殘留限量[8-9]。光學(xué)生物傳感器主要包括：熒光生物傳感器、表面等離子體共振傳感器、表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器、共振瑞利散射光譜傳感器等。

1 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器主要是利用熒光材料通過(guò)靜電吸附、共價(jià)偶聯(lián)或親和素-生物素系統(tǒng)與生物材料偶聯(lián)形成檢測(cè)探針，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化對(duì)樣品中的抗生素含量進(jìn)行檢測(cè)?；谟袡C(jī)染料的傳統(tǒng)熒光生物傳感器熒光易猝滅、靈敏度低、穩(wěn)定性差，隨著納米材料科技的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)發(fā)出了很多具有熒光壽命長(zhǎng)、熒光強(qiáng)度高、發(fā)射光譜可調(diào)等特點(diǎn)的新型熒光納米材料，如量子點(diǎn)、熒光微球、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒等，新型熒光納米材料的應(yīng)用大幅提高了熒光生物傳感器的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性[4,10]。

Taranova等以3種量子點(diǎn)為標(biāo)記物，分別與氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素的抗體偶聯(lián)作為檢測(cè)探針，可在10 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出牛奶中的3種抗生素，該方法的檢測(cè)靈敏度高，對(duì)氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素的最低檢測(cè)限分別為0.3、0.12、0.2 ng·mL-1，比用相同抗體建立的酶聯(lián)免疫吸附方法的最低檢測(cè)限低80～120倍[11]。Wang 等通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)方法將熒光微球與替米考星抗體偶聯(lián)，定量檢測(cè)牛奶中的替米考星殘留，檢測(cè)線性范圍為0.02～2.10 ng·mL-1，檢測(cè)靈敏度為0.19 ng·mL-1[12]。Wu 等建立了基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的新型熒光生物傳感器，該方法中結(jié)合了高親和力的適配體、磁分離技術(shù)以及高靈敏的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒，提高了對(duì)氯霉素檢測(cè)的靈敏度和特異性，牛奶中的氯霉素的最低檢測(cè)限可低至0.01 ng·mL-1[13]。2018 年，He 等將石墨烯量子點(diǎn)與適配體標(biāo)記，建立了量子點(diǎn)生物傳感器高靈敏檢測(cè)牛奶中的磺胺嘧啶，最低檢測(cè)限可以低至5.0 pg·mL-1[14]。以上結(jié)果表明基于新型熒光納米材料的熒光生物傳感器可以用于高靈敏地檢測(cè)食品中一種或多種抗生素殘留。

2 表面等離子體共振傳感器

當(dāng)一束光以臨界角入射到棱鏡和金屬界面時(shí)會(huì)產(chǎn)生全反射效應(yīng)，在一定條件下引起金屬膜表面自由電子共振吸收光能量，從而使反射光完全消失，這種現(xiàn)象稱(chēng)為表面等離子體共振（SPR）。SPR生物傳感器檢測(cè)抗生素殘留的原理是：在SPR傳感器表面固定能特異性識(shí)別抗生素的抗體、適配體等生物材料，當(dāng)含有目標(biāo)抗生素的樣品溶液流經(jīng)傳感器表面時(shí)，抗生素與生物材料之間的結(jié)合會(huì)引起傳感器表面質(zhì)量的變化，從而導(dǎo)致光折射率的改變，可以對(duì)樣品中的抗生素殘留進(jìn)行定量分析。SPR生物傳感器具有免標(biāo)記、靈敏度高、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[15-17]。

Luo等通過(guò)光聚合方法合成環(huán)丙沙星的分子印跡材料并將其鍵合在SRP 芯片上，建立了基于分子印跡材料的SPR 生物傳感器檢測(cè)環(huán)丙沙星，檢測(cè)線性范圍為10-11～10-7mol·L-1，具有良好穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性[18]。Tomassetti等建立了基于類(lèi)“三明治夾心”模式的SPR 生物傳感器檢測(cè)氨芐青霉素，首先在SPR 芯片表面鍵合巰基十一烷酸，然后通過(guò)活潑酯法偶聯(lián)氨芐青霉素，再結(jié)合氨芐青霉素抗體，最后以類(lèi)“三明治夾心”的模式檢測(cè)氨芐青霉素，可在20 min內(nèi)完成對(duì)10-3～10-1mol·L-1的氨芐青霉素的定量檢測(cè)[19]。Fernández等制備了一種六通道的SPR生物傳感器同時(shí)對(duì)牛奶中的三類(lèi)抗生素進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)恩諾沙星、磺胺吡啶和氯霉素的最低檢測(cè)限分別為0.3、0.29、0.26 ng·mL-1[20]。雖然SPR生物傳感器的響應(yīng)靈敏度高且檢測(cè)迅速，但是可能儀器設(shè)備昂貴，相關(guān)報(bào)道主要集中在2010 年之前，而近幾年有關(guān)SPR 生物傳感器在抗生素殘留檢測(cè)方面的文獻(xiàn)較少。

3 表面增強(qiáng)拉曼光譜生物傳感器

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）是指將待測(cè)分子吸附在粗糙的貴金屬材料表面，可使待測(cè)物的拉曼信號(hào)增強(qiáng)的光譜現(xiàn)象。SERS 生物傳感器用于抗生素的殘留檢測(cè)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保等特點(diǎn)。

Qu等以銀納米顆粒和碳納米管插層的氧化石墨烯薄膜作為增強(qiáng)拉曼的襯底，因?yàn)檠趸┡c抗生素之間通過(guò)π-π共軛和靜電吸附結(jié)合，大幅增強(qiáng)SERS生物傳感器的檢測(cè)靈敏度，可以高靈敏檢測(cè)水溶液中nM級(jí)別的土霉素、氨芐西林和四環(huán)素，最低檢測(cè)限分別為0.38、1.29、0.77 ng·mL-1[21]。Chen等制備銀納米顆粒修飾拉曼基底，建立了一種簡(jiǎn)單靈敏的SERS 生物傳感器檢測(cè)牛奶中的青霉素G，通過(guò)參數(shù)優(yōu)化，本方法的最低檢測(cè)限為0.85 ng·mL-1，遠(yuǎn)低于最大殘留限量4.0 ng·mL-1[22]。2018 年，Shi等建立了一種SERS 生物傳感器可以同時(shí)檢測(cè)新霉素和8 種喹諾酮類(lèi)抗生素，最低檢測(cè)限分別為0.37 pg·mL-1（新霉素）和0.55 pg·mL-1（諾氟沙星）[23]。但是目前SERS生物傳感器檢測(cè)抗生素主要是以水溶液或緩沖液為基質(zhì)而不是實(shí)際樣本，Chen 等的研究表明，由于牛奶樣本中蛋白等雜質(zhì)的干擾，建立的SERS 生物傳感器檢測(cè)牛奶中氯霉素的最低檢測(cè)限高于水溶液，所以如何提高SERS信號(hào)強(qiáng)度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性是SERS 生物傳感器檢測(cè)抗生素的關(guān)鍵點(diǎn)[24]。

4 共振瑞利散射生物傳感器

在瑞利散射實(shí)驗(yàn)中，若選擇入射光波長(zhǎng)接近待測(cè)物的吸收帶，由于電子吸收電磁波的頻率與其散射頻率相同，電子因共振而強(qiáng)烈吸收散射光的能量而發(fā)生再次散射，其散射強(qiáng)度通常較單一的瑞利散射提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，并且不再遵守散射強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方成反比的瑞利散射定律，這種吸收-再散射的過(guò)程稱(chēng)為共振瑞利散射（RRS）[25-26]。RRS 生物傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[27]。

研究結(jié)果表明，在醋酸-醋酸鈉緩沖介質(zhì)中，諾氟沙星能與稀土鋱離子和釔離子反應(yīng)形成雙核配合物，使溶液在365 nm 處的RRS 峰增強(qiáng)；在Tris-HCl緩沖介質(zhì)中，左氧氟沙星與陽(yáng)離子的甲基紫及鎢酸鈉三者反應(yīng)形成三元離子締合物，導(dǎo)致溶液377 nm 處的RRS 峰增強(qiáng)，因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，建立了基于RRS 的傳感器檢測(cè)牛奶中諾氟沙星和左氧氟沙星殘留，該方法最低檢測(cè)限分別為4.1×10-10和7.4×10-9mol·L-1[28]。靜電效應(yīng)導(dǎo)致量子點(diǎn)帶表面帶正電而導(dǎo)致量子點(diǎn)聚集，從而能大幅增強(qiáng)RRS 信號(hào)，因?yàn)閹€基乙酸能與氨基糖苷類(lèi)抗生素通過(guò)肽鍵進(jìn)行高親和力的結(jié)合，所以基于巰基乙酸-量子點(diǎn)的RRS傳感器檢測(cè)氨基糖苷類(lèi)抗生素的靈敏度能得到有效提高，最低檢測(cè)限可以低至2～5.1 ng·mL-1[29-30]。2013 年，Shen 等制備了巰基乙酸修飾的量子點(diǎn)，并將其用于建立RRS傳感器檢測(cè)水中的多粘菌素B，最低檢測(cè)限可達(dá)6.36 ng·mL-1[31]。根據(jù)之前的研究結(jié)果，通過(guò)離子締合作用和量子點(diǎn)聚集都可以直接或者間接地增加分子量從而使RRS信號(hào)增強(qiáng)。但是目前RRS 生物傳感器主要是用于水或者緩沖體系中抗生素的分析檢測(cè)，由于實(shí)際食品樣品中基質(zhì)效應(yīng)的影響，RRS生物傳感器應(yīng)用于食品樣品中抗生素的殘留檢測(cè)任重而道遠(yuǎn)。

5 結(jié) 論

與傳統(tǒng)方法相比，光學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)為抗生素的殘留檢測(cè)提供了新途徑。但是目前抗生素污染范圍廣、污染種類(lèi)多、殘留量低、且樣品基質(zhì)復(fù)雜，限制了光學(xué)生物傳感器在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用與推廣。為了滿(mǎn)足檢測(cè)現(xiàn)狀要求，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的新型材料和技術(shù)將被應(yīng)用于抗生素的殘留檢測(cè)，且縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)靈敏度、降低檢測(cè)成本、減弱基質(zhì)效應(yīng)、以及實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)是食品安全中抗生素殘留檢測(cè)發(fā)展的方向。