左旋咪唑殘留危害及檢測方法研究進展

魏中鋒，周 麗，張 倩，董翠梅，宇 凌

（1.山東省菏澤市動物疫病預(yù)防控制中心，山東 菏澤 274000；2.山東省菏澤市牡丹區(qū)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，山東 菏澤 274000；3.山東省成武縣畜牧獸醫(yī)局，山東 菏澤 274000）

1 左旋咪唑在畜牧業(yè)的應(yīng)用現(xiàn)狀

左旋咪唑（levamisole），分子式為C11H12N2S，是人工合成的咪唑并噻唑類廣譜、高效、安全的驅(qū)蟲藥，對牛、豬、綿羊、犬和雞的等大部分線蟲都具有較好的驅(qū)殺效果，又因其藥源豐富，性質(zhì)穩(wěn)定，所以臨床上應(yīng)用十分廣泛。具有驅(qū)蟲活性，驅(qū)蟲機理目前認(rèn)為是通過抑制蟲體肌肉延胡索酸還原酶的活性，使蟲體糖代謝終止，導(dǎo)致蟲體肌肉麻痹。被世界衛(wèi)生組織推薦為治療蛔蟲及鉤蟲的藥物。左旋咪唑除了具有驅(qū)蟲活性外，還對免疫反應(yīng)有明顯影響?？苫謴?fù)外周T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能，對單核細(xì)胞的吞噬有興奮作用，對免疫功能受損的動物作用更明顯。左旋咪唑還可以增強布魯氏菌疫苗等的免疫反應(yīng)和效果。國外也有相關(guān)報道證明，左旋咪唑作為改良的佐劑可用于改善病毒滅活疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在2000年喬彥良等就發(fā)表了關(guān)于左旋咪唑?qū)﹄u細(xì)胞免疫和體液免疫功能的影響的文章[1]。另有試驗報道左旋咪唑?qū)ξ鲗幠膛龊伤固姑谌槟膛?3頭的隱性乳房炎的防治也有明顯的效果[2]。左旋咪唑還能夠增強抗體的產(chǎn)生水平和機體巨噬細(xì)胞功能，臨床上還可用于動物的抗病毒、抗菌消炎、抑制腫瘤和促進生長等方面[3]。左旋咪唑還有很好的協(xié)同作用，是治療某些疾病時的輔助性藥物。柳風(fēng)祥等研究表明，左旋咪唑黨參多糖可以提高胸腺、法氏囊和腎臟的指數(shù)，尤其高劑量組的提高效果更為明顯[4]。

2 左旋咪唑藥物殘留的危害

左旋咪唑臨床制劑為獸藥非處方藥，隨著左旋咪唑使用范圍的不斷擴大，養(yǎng)殖戶為追求經(jīng)濟利益，違規(guī)超量使用，造成藥物在動物源性可食用組織中的殘留。澳大利亞胃腸道線蟲是限制乳品企業(yè)發(fā)展的疾病之一，特別影響泌乳早期產(chǎn)奶和小母牛的增重。農(nóng)民依賴驅(qū)蟲劑來控制寄生蟲病的發(fā)生，長期、連續(xù)地使用驅(qū)蟲藥物，導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)的殘留。盡管動物源食品中獸藥殘留的水平比較低，但長期食用這類動物源食品，藥物殘留會隨食物鏈間接的在人體內(nèi)堆積，最終產(chǎn)生病變，從而造成實質(zhì)性和難以逆轉(zhuǎn)的危害[5]。有統(tǒng)計報道顯示，在2007年前左旋咪唑嚴(yán)重不良反應(yīng)約有600多例，文獻中左旋咪唑引起的黃疸性肝炎病1例，大劑量左旋咪唑致急性腎功能衰竭2例，左旋咪唑所致腦病10例等[6-8]。

隨著左旋咪唑在臨床上廣泛使用，甚至過量超量使用，會導(dǎo)致動物機體耐藥性以及動物源性可食用組織中左旋咪唑的殘留問題，如果左旋咪唑在人體有過量的蓄積，有一定的腎毒性及肝臟毒性，對人體還有致畸、致癌的危害，嚴(yán)重影響人體健康[9-12]。在JECFA第36次會議上，建立的日允許攝入量（ADI）為3 μg·kg-1·d-1。楊學(xué)志等發(fā)表了關(guān)于左旋咪唑上市后安全性再評價Ⅲ：風(fēng)險預(yù)防對策的文獻[13]。其文獻表明，左旋咪唑有涉及多種器官和系統(tǒng)嚴(yán)重不良反應(yīng)，其中最為常見的是神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦炎綜合征、脫髓鞘腦病、錐體外系反應(yīng)等。

3 左旋咪唑的最高殘留限量和休藥期

隨著人們生活水平的日益提高，食品安全問題也成為我們?nèi)粘Ｉ钪械慕裹c問題。目前許多發(fā)達(dá)國家頒布了許多關(guān)于動物源食品中獸藥殘留的法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)，制定了詳盡的獸藥殘留檢測方法，并且嚴(yán)格實施對其監(jiān)控、檢測與監(jiān)督。所以為完善動物養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)范生產(chǎn)和合理用藥，保障動物源性食品安全，保障我們的身體健康，提高我們的生活質(zhì)量，有必要對動物性食品中左旋咪唑殘留量進行嚴(yán)格監(jiān)控，建立相應(yīng)的檢測方法和檢測標(biāo)準(zhǔn)。美國、日本等許多國家均制定了相關(guān)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)。我國也出臺了有關(guān)牛奶及肉制品的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

大鼠放射標(biāo)定的代謝臨床試驗表明，其中主要代謝物是對羥基左旋咪唑，毒性比其母體的化合物的毒性要低許多。所以，左旋咪唑的殘留檢測中標(biāo)識化合物認(rèn)定為左旋咪唑母體藥體就可以滿足要求[14-17]。為加強獸藥殘留監(jiān)測工作，農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日發(fā)布公告，第235號公告中左旋咪唑為批準(zhǔn)使用獸藥，按照農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)簽說明書規(guī)定，使用于食品動物，但要求有最高的殘留限量。公告附表中規(guī)定左旋咪唑Levamisole的日允許攝入量（ADI）為0～6 μg·kg-1·d-1，標(biāo)志殘留物為Levamisole，牛、羊、豬、禽的肌肉、脂肪和腎臟的最高殘留限量為10μg·kg-1。在肝臟中的最高殘留限量為100μg·kg-1。

鹽酸左旋咪唑注射液按規(guī)定用法與用量使用，其休藥期為牛14 d，羊、豬、禽28 d。

4 左旋咪唑殘留方法研究進展

目前，國內(nèi)外針對檢測左旋咪唑的方法主要有電位滴定法、拉曼分析法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。

我國對獸藥殘留的研究起步較晚，檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)制定嚴(yán)重滯后。農(nóng)業(yè)部在1993年開始組織研究獸藥殘留檢測方法，迄今為止，農(nóng)業(yè)部制定并發(fā)布的獸藥殘留檢測方法標(biāo)準(zhǔn)可操作性也有很大的提高。20世紀(jì)60年代初，美國就開始關(guān)注獸藥殘留問題，1975年制訂了《國家殘留計劃》（NRP），對屠宰動物可能存在的殘留進行監(jiān)控和調(diào)查，并把常用的獸藥建立了監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)方法。隨著科技的飛速發(fā)展和對獸藥認(rèn)識的不斷深化，原本認(rèn)為安全的獸藥（化學(xué)物）實際使用過程中卻被發(fā)現(xiàn)對人類或動物有嚴(yán)重的毒性作用。曾大量用作動物促生長劑的喹乙醇，后來也發(fā)現(xiàn)有致癌或致突變的不良作用。目前許多國家把這些藥物列為禁用藥物，并且在動物性食品中要求零殘留（一般都要求 1μg·kg-1）。

左旋咪唑用電位滴定測定含量來源于《中國獸藥典2015年版》二部，方法簡單易行，樣品也不用進行復(fù)雜的處理，氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L-1）進行滴定測其含量即可，針對原料及其制劑檢測可行性還是很好的，但這對于動物性食品中藥物殘留的定性定量檢測則是有難度的，生物樣品的干擾物質(zhì)較多。

高效液相法（HPLC）是目前較為普遍的方法之一，我國也出臺了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》GB29681-2013，HPLC法。其檢測限為2.5 μg·kg-1，定量限為5 μg·kg-1。曾勇等對豬雞組織中左旋咪唑殘留的高效液相檢測方法的研究中，左旋咪唑濃度在10～1 000 μg·L-1時，與峰面積有良好的線性關(guān)系，雞、豬的肝臟中的定量限為10 μg·kg-1，雞、豬的肌肉、腎臟及脂肪中的定量限為5 μg·kg-1，回收率均在70%～110%[18]。另有試驗測定奶粉中的左旋咪唑等。高效液相法其優(yōu)點分析時間短，測定范圍較廣，可檢測的物質(zhì)比較多，如果配備不同的檢測器，結(jié)合衍生實驗的特點還可以檢測絕大多數(shù)的化合物。液相的精密度較高，其判定標(biāo)準(zhǔn)為RSD＜2%，也可以做左旋咪唑的定性定量分析，定量限也可以達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。但加標(biāo)回收率不高，有雜質(zhì)峰干擾[19-26]。

關(guān)于氣相色譜法及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的研究文獻也有許多。張叢蘭建立了豬、雞、羊可食用組織中左旋咪唑殘留氣相色譜法的檢測方法[27]。徐靜等利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測動物食品中左旋咪唑的殘留[28]。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法的優(yōu)點是簡便，穩(wěn)定性好，樣品加標(biāo)回收率可達(dá)到76%～106%，定量限為5 μg·kg-1。但在實際監(jiān)督檢測中，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的使用不如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜廣，氣相色譜可檢測的物質(zhì)只有易揮發(fā)物質(zhì)，并且氣相色譜的精密度一般約10%，試驗誤差較大。從安全性考慮，如果是配備FID的氣相色譜，其氫氣源，無論是鋼瓶的還是發(fā)生器的，都有一定危險性。如果是配備ECD的氣相色譜，在使用中不當(dāng)或者處理不當(dāng)，就可能會造成ECD中的放射源的泄漏，從而導(dǎo)致放射污染等。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種先通過液相進行分離，然后通過質(zhì)譜進行檢測分析的技術(shù)，不但對混合物中的單個化合物進行定性工作，而且通過質(zhì)譜的高靈敏度的特點，對低濃度樣品的進行定量檢測。我國已出臺牛奶和奶粉中左旋咪唑殘留量液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法GB/T22994-2008。其原理是在堿性環(huán)境下用乙酸乙酯提取樣品中左旋咪唑的殘留，用稀鹽酸將樣品中的左旋咪唑反萃取到鹽酸層，再用強離子交換柱進行凈化，氮氣吹干后，復(fù)溶過濾后上機，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，外標(biāo)法定量分析。牛奶和奶粉的檢出限分別為0.4和3.2 μg·kg-1，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點是定性準(zhǔn)確，定量限低，分析時間短。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其有較高的靈敏度和較高的專屬性、可以對組分進行定性定量分析的特點被廣泛使用。目前急需解決的是用液-質(zhì)聯(lián)用建立一套動物性食品中左旋咪唑殘留量的檢測技術(shù)體系，為全方位開展動物性食品中左旋咪唑殘留量的檢測提供便利。