長鏈非編碼RNA在脊髓損傷中的研究進展

周恒星，亢毅，李雪瑩，史仲舉，盧璐，張馳，劉路，婁永富，蔡志威，馮世慶*

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津 300070)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種高發(fā)生率、高致殘率、高死亡率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，其病理過程主要包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩個損傷階段。在骨折、壓迫等導(dǎo)致的原發(fā)性損傷后，繼發(fā)的炎癥反應(yīng)、組織缺氧、神經(jīng)元壞死凋亡、局部抑制性微環(huán)境等一系列病理生理的變化進一步加重了脊髓損傷，進而導(dǎo)致嚴重的感覺和運動功能障礙[1-2]。因此，探究SCI后病理生理改變的發(fā)生機制對于脊髓損傷的研究和修復(fù)具有極其重要的意義。長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)被定義為長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本[3]。目前已有研究表明，lncRNAs可以通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾來調(diào)節(jié)下游基因的表達，這被認為是許多疾病研究的新方向[4]。目前關(guān)于lncRNAs在SCI中作用的研究相對較少，且缺乏較為全面的綜述。本文對近年來lncRNAs在SCI中的分子功能相關(guān)的研究進行了綜述，并進一步探討了lncRNAs作為SCI預(yù)后相關(guān)生物標志物及治療靶點等方面的潛在作用，旨在較為全面的了解lncRNAs在SCI中所發(fā)揮的作用。

1 lncRNAs的生物發(fā)生、分類及功能

1.1 lncRNAs的生物發(fā)生 非編碼RNA(Non-coding RNAs，ncRNAs)在人類基因組中所占比例超過98%[3]。lncRNAs是一類超過200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本亞群，大部分lncRNAs由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，有5'-甲基化帽子及3'-多聚腺苷酸(polyA)尾[3]。lncRNAs最初被認為是轉(zhuǎn)錄組的“轉(zhuǎn)錄噪音”[4-5]。近年來，lncRNAs的研究迅速發(fā)展，越來越多的研究者認識到lncRNAs是基因表達等許多細胞生命過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。與信使RNA(messenger RNA，mRNA)相比，lncRNAs通常受到精細調(diào)控，且具有明顯的組織表達特異性和細胞表達特異性[7]。

1.2 lncRNAs的分類 根據(jù)lncRNAs母本基因在基因組中的位置，可分為五種類型[8-10]：a)正義lncRNAs，其轉(zhuǎn)錄方向與鄰近mRNA轉(zhuǎn)錄方向相同；b))反義lncRNAs，其轉(zhuǎn)錄方向與鄰近mRNA轉(zhuǎn)錄方向相反；c)雙向lncRNAs，該lncRNAs可同時從與鄰近mRNA轉(zhuǎn)錄方向相同與相反兩個方向發(fā)生轉(zhuǎn)錄；d)內(nèi)含子lncRNAs，由基因的內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；e)長鏈基因間lncRNAs(long intergenic non-coding RNAs，lincRNAs)，即從兩個基因之間的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。

1.3 lncRNAs的功能 lncRNAs的主要功能[6-10]如下：a)作為支架分子，穩(wěn)定染色質(zhì)修飾復(fù)合物；b)作為引導(dǎo)分子，引導(dǎo)包含RNA結(jié)合蛋白的蛋白復(fù)合體定位到調(diào)控位點；c)作為信號分子，通過識別轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的表達；d作為誘餌分子，與相應(yīng)分子結(jié)合并阻斷其對靶基因的作用；e)充當miRNA“海綿”，通過競爭性吸附與mRNA結(jié)合的微小RNA(MicroRNA，miRNA)進而調(diào)節(jié)mRNA活性；f)作為增強子RNAs，甚至可以編碼具有調(diào)節(jié)功能的短肽。但是目前仍有大量lncRNAs的生物學(xué)意義尚不清楚，需要進一步研究闡明。

2 SCI后lncRNAs的表達變化及其調(diào)控

為明確SCI后lncRNAs的表達水平變化及其在脊髓損傷中的作用，研究者進行了一系列基因芯片和RNA測序研究。Wang等[11]對大鼠脊髓挫傷后1、4、7 d lncRNAs的表達進行了大規(guī)模篩選，以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.001且倍數(shù)變化≥2的轉(zhuǎn)錄本作為差異表達lncRNAs，發(fā)現(xiàn)在成年大鼠脊髓中7個lncRNAs的表達出現(xiàn)了明顯的變化，其中2個(LOC100910973，H19)上調(diào)，1個(RGD1559747)下調(diào)，4個(Rn28s，Rn45s，RT1-CE6，Rmrp)在SCI后1d上調(diào)、4d和7d下調(diào)；Ding等[12]在小鼠脊髓挫傷后1 d、3 d、1周和7周進行基因芯片檢測，結(jié)果顯示與對照組相比，lncRNAs在SCI后1d幾乎沒有表達變化，SCI后1周變化達到高峰，隨后出現(xiàn)表達下降。Duran等[13]利用RNA測序研究SCI的亞慢性和慢性階段(SCI后1個月、3個月和6個月)lncRNAs表達的變化，共鑒定到277個差異表達的lncRNAs。這些lncRNAs的研究表明lncRNAs表達變化對SCI后的許多病理生理過程都有影響，為SCI的分子機制解析提供新的研究方向。

3 lncRNAs對神經(jīng)細胞行為的調(diào)控作用

3.1 神經(jīng)元 脊髓損傷后，永久性神經(jīng)元喪失是導(dǎo)致機體感覺、運動功能障礙的一個主要原因，因此增加SCI后神經(jīng)元存活對于SCI患者的功能恢復(fù)至關(guān)重要[1-2]。目前，已有研究表明調(diào)節(jié)基因表達可以促進創(chuàng)傷后脊髓神經(jīng)元的存活，其中l(wèi)ncRNAs的調(diào)節(jié)是重要途徑[14]。lncRNAs已被發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生中起到重要作用[15]。同時，相關(guān)研究表明lncRNAs的表達與神經(jīng)元行為相關(guān)[15-18]。Lv等[16]證實lncRNA-Map2k4可以通過miR-199a/FGF1途徑促進神經(jīng)元增殖并抑制神經(jīng)元凋亡。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性lncRNA IGF2AS促進了DRG神經(jīng)元的生長并可以減輕局部麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。Pnky是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的神經(jīng)細胞特異性lncRNA[15]。Ramos等[15]的研究表明，敲低Pnky可促進神經(jīng)干細胞分化，這一結(jié)果有利于提高SCI患者神經(jīng)干細胞移植的治療效果。Han等[18]報道lncRNA H19可能通過“海綿機制”吸附miRNA let-7b，調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡。以上研究為探索lncRNAs在神經(jīng)元行為中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)，同時預(yù)示著調(diào)控相關(guān)lncRNAs表達可能是修復(fù)脊髓損傷的一種潛在方法。

3.2 星形膠質(zhì)細胞 星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一種膠質(zhì)細胞，它們在向神經(jīng)元提供能量代謝物和維持細胞外離子平衡方面發(fā)揮著重要作用[19]。脊髓損傷后，星形膠質(zhì)細胞增殖和反應(yīng)性膠質(zhì)增生促進膠質(zhì)瘢痕的形成，而膠質(zhì)瘢痕在SCI局部微環(huán)境中作為物理和化學(xué)屏障，抑制脊髓功能的恢復(fù)[19]。但是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞也能提供內(nèi)源性神經(jīng)保護以及分泌促生長神經(jīng)營養(yǎng)因子[20]。因此，如何充分利用其有利方面，抑制其不利方面，將是今后的研究重點。最近已有研究開始探索lncRNAs對星形膠質(zhì)細胞增殖和反應(yīng)性膠質(zhì)增生的影響。通過敲低星形膠質(zhì)細胞中l(wèi)ncSCIR1的表達，發(fā)現(xiàn)lncSCIR1的下調(diào)可促進星形膠質(zhì)細胞的體外增殖和遷移，并可能在SCI的病理生理過程中發(fā)揮著不利作用[11]。另一項研究顯示，lncRNA Gm4419可以通過上調(diào)炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)的表達來促進創(chuàng)傷誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞凋亡，而TNF-α的上調(diào)可能通過競爭性結(jié)合miR-466l來實現(xiàn)[21]。因此，篩選和鑒定調(diào)控星形膠質(zhì)細胞增殖和活化的關(guān)鍵lncRNAs已成為SCI治療中的重要問題。

3.3 少突膠質(zhì)細胞 少突膠質(zhì)細胞(oligodendrocytes，OLs)的凋亡和軸突脫髓鞘是脊髓損傷繼發(fā)性損傷的重要組成部分[1-2]。此外，損傷后微環(huán)境中增加的軸突生長抑制因子限制了內(nèi)源性少突膠質(zhì)細胞的生成和軸突再髓鞘化過程[22]。因此，增強軸突再髓鞘化的能力是促進SCI后感覺、運動功能恢復(fù)的重要因素之一。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs有望成為脊髓損傷修復(fù)的治療靶點，因此有必要了解lncRNAs在軸突再髓鞘化中的作用。He等[23]建立了少突膠質(zhì)細胞不同發(fā)育階段lncRNAs的動態(tài)表達譜，發(fā)現(xiàn)lncOL1的過表達可促進大腦發(fā)育中早熟的少突膠質(zhì)細胞分化，lncOL1的失活可導(dǎo)致?lián)p傷后CNS軸突髓鞘形成障礙和再髓鞘化缺陷，此外，lncOL1可通過與Suz12的相互作用促進少突膠質(zhì)細胞成熟。Dong[24]等的研究表明少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyte precursor cell，OPC)的分化過程中受到lncRNAs的調(diào)控，其中l(wèi)nc-OPC的表達最高，且在OPC中表現(xiàn)出高度特異性表達。lncRNAs對脊髓神經(jīng)元軸突髓鞘形成及再髓鞘化的影響仍需進一步研究，以期為SCI的治療提供有用的線索。

3.4 小膠質(zhì)細胞 脊髓損傷后繼發(fā)性損傷階段的炎癥反應(yīng)涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的多種細胞，包括神經(jīng)元、大膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，其中小膠質(zhì)細胞為主要炎癥細胞[1-2]。活化的小膠質(zhì)細胞可以釋放多種促炎分子，如白介素-1β、TNF-α、活性氧和一氧化氮，進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[25]。SCI后，小膠質(zhì)細胞的細胞形態(tài)和功能發(fā)生變化，小膠質(zhì)細胞的活化常被用來作為神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生的標志[25]。最近的一項研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage，SAH)后早期腦損傷(early brain injury，EBI)中，lncRNA fantom3_ F730004F19可能通過TLR信號通路(toll-like receptor signalling pathway)影響小膠質(zhì)細胞炎癥[26]。Qi等[26]發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG14可通過抑制miR-145-5p而增加PLA2G4A的表達，從而激活小膠質(zhì)細胞。活化的小膠質(zhì)細胞可分為兩種功能類型：M1型和M2型，M1極化的小膠質(zhì)細胞通常被認為促進神經(jīng)元凋亡并抑制OPCs分化為成熟的OLs，而M2極化的小膠質(zhì)細胞被認為促進神經(jīng)元存活、神經(jīng)突起生長和OPCs分化[27]。Sun等[28]的研究將lncRNA GAS5確定為小膠質(zhì)細胞極化的表觀遺傳調(diào)控位點，并認為GAS5可能是治療脫髓鞘疾病的靶點。Wen等[29]的研究表明，lncRNA Ptprj-as1激活小膠質(zhì)細胞NF-κB通路，促進炎性細胞因子分泌，參與腦出血導(dǎo)致的炎性損傷。

4 lncRNAs參與脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)

脊髓損傷后，炎癥反應(yīng)包括小膠質(zhì)細胞的活化和中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞的浸潤，其中中性粒細胞是首先進入損傷部位的主要炎癥細胞[30]。研究表明中性粒細胞中存在許多l(xiāng)ncRNAs，并且lncRNAs的表達水平與中性粒細胞的發(fā)育、分化和活化相關(guān)[31]。已有研究報道lncRNAs在B淋巴細胞和T淋巴細胞的發(fā)生發(fā)展、活化中具有特異性表達[32-33]。Panzeri等[34]發(fā)現(xiàn)lincRNAs可促進人類淋巴細胞分化。Mirsafian等[35]對來自4名患者樣本進行單核細胞RNA測序，并將其數(shù)據(jù)與其他11個數(shù)據(jù)集合并分析，得到了單核細胞中的lncRNAs譜。Huang等[36]發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00341可抑制血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，Vcam1)的表達和單核細胞粘附，且具有抗炎作用。Zhang等[37]揭示了lncRNA LINC00305可以通過激活A(yù)HRR-NF-κB途徑來促進單核細胞炎癥。Zhou等[38]的研究表明，大鼠SCI后lncRNA MALAT1表達明顯上調(diào)，上調(diào)的lncRNA MALAT1可激活I(lǐng)KKβ/NF-κB通路，并通過下調(diào)miR-199B促進促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生；而敲低MALAT1，可促進SCI大鼠運動功能恢復(fù)及抑制炎癥因子表達。盡管已有相關(guān)文獻報道lncRNAs可調(diào)節(jié)SCI后炎癥反應(yīng)，但目前大部分lncRNAs調(diào)節(jié)炎癥的相關(guān)機制尚不完全清楚。因此，需要進一步的實驗來探索lncRNAs在SCI后調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的具體機制。

5 lncRNAs參與脊髓損傷后的血管形成

脊髓損傷后造成細胞和組織損傷的另一個重要原因是血管損傷引起的缺血缺氧狀態(tài)[1-2]。因此，如何促進血管損傷后血管的形成和再通，為受損脊髓提供氧氣、生長因子及其他營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，是脊髓損傷修復(fù)的一個關(guān)鍵問題。研究表明，lncRNA HIF1A-AS2可促進缺氧時人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的血管生成，其可能作為miR-153-3p海綿促進缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF-1a)上調(diào)，進而促進新生血管的形成[39]。lncRNA MEG3被認為是一些癌癥的重要的腫瘤抑制劑，MEG3的過度表達顯著抑制血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)中的血管生成[40]。此外，缺血性卒中后MEG3顯著降低，而過表達MEG3可通過抑制Notch信號降低缺血性卒中后毛細血管密度[41]。因此，MEG3同樣可能在SCI后血管生成的控制中發(fā)揮重要作用。此外，F(xiàn)iedler等[42]的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞缺氧會誘導(dǎo)兩個lincRNAs：linc00323-003和MIR503HG的表達量增加，進而促進血管生成。Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA snhg 1對腦微血管內(nèi)皮細胞存活和血管生成具有促進作用，其依賴于miR-199a，同時miR-199a參與HIF-1a和血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)表達的調(diào)節(jié)。總之，越來越多的證據(jù)表明lncRNA在血管生成中起重要作用，但是這些lncRNAs在脊髓損傷后血管生成中的作用尚需進一步實驗驗證。

6 結(jié)論與展望

脊髓損傷是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病，其病理生理改變涉及神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和血管系統(tǒng)等多個系統(tǒng)，同時在SCI的發(fā)生發(fā)展過程中多種分子機制和信號通路參與其中。SCI涉及多種復(fù)雜的病理生理過程，其分子機制尚不完全明確，目前尚無有效的修復(fù)策略修復(fù)SCI后的繼發(fā)性損傷。SCI后lncRNAs的表達變化可能在SCI的病理過程中起著關(guān)鍵作用，lncRNAs的發(fā)現(xiàn)和相關(guān)研究為SCI的修復(fù)提供了新的方向。與可靶向多個mRNAs的miRNAs相比，lncRNAs有更高的組織細胞特異性，預(yù)示著其作為治療靶點、生物標志物等更具優(yōu)勢。在本綜述中，我們總結(jié)了近年來有關(guān)lncRNAs在SCI中的研究，我們認為這一綜述將有助于全面了解SCI的分子機制，為lncRNAs臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

此外，尚有幾個問題可能成為今后研究的重點。首先，大部分關(guān)于lncRNAs對SCI作用的研究都是小動物研究，為了促進向臨床治療的轉(zhuǎn)化，還需要對非人靈長類進行相關(guān)的研究，以驗證利用lncRNAs修復(fù)脊髓損傷在靈長類中的安全性和有效性。其次，應(yīng)用lncRNAs治療需要合適的遞送系統(tǒng)，因此如何選擇合適的載體來確保lncRNAs高效、定向的遞送到相應(yīng)靶點是未來的研究方向。同時，SCI中大部分lncRNAs的功能及其發(fā)揮作用的分子機制尚不完全清楚，因此進一步深入了解SCI中l(wèi)ncRNAs的功能及其發(fā)揮相應(yīng)功能的調(diào)節(jié)機制，選擇關(guān)鍵的lncRNAs，將為SCI的修復(fù)提供新的思路和方向。