LC-MS/MS法測(cè)定煙草中7種高級(jí)脂肪酸

馬麗伊，徐志強(qiáng)，田振峰，趙愛(ài)俠，淦五二*

1 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)系，合肥 230026；

2 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，合肥 230088

高級(jí)脂肪酸對(duì)煙葉品質(zhì)具有重要影響[1-6]，并且是評(píng)價(jià)烤煙品質(zhì)的有效指標(biāo)[6]。煙草中飽和高級(jí)脂肪酸能增加煙氣的脂肪或蠟味，其中，肉豆蔻酸能柔和煙氣，與煙香諧調(diào)，提高甜而醇和的風(fēng)味；棕櫚酸有甜的蠟脂氣息，能增加豐滿度；但亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸會(huì)增加煙氣刺激性[7]。

煙草及煙草制品中高級(jí)脂肪酸的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[8-11]和液相色譜法[12-13]。采用氣相色譜分析時(shí)，衍生化樣品操作較麻煩，處理步驟多，而且會(huì)對(duì)樣品造成損失。對(duì)于液相色譜法來(lái)說(shuō)，由于脂肪酸紫外吸收很弱，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)需柱前衍生化，但在衍生過(guò)程中易發(fā)生異構(gòu)化、氧化、分解等副反應(yīng)且很難保證衍生化完全。用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可直接檢測(cè)脂肪酸，但靈敏度低，無(wú)法檢測(cè)到低含量的高級(jí)脂肪酸。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)靈敏度高、選擇性好，是非揮發(fā)性成分定性、定量測(cè)定的有效手段[14-15]。本文建立了一種快速、準(zhǔn)確的LC-MS/MS測(cè)定高級(jí)脂肪酸檢測(cè)方法。所研方法樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)需衍生化，提取的樣品可直接進(jìn)樣分析，適用于分離、定量煙草中高級(jí)脂肪酸。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

（1）試劑：十七烷酸（98%）、亞麻酸（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），油酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司），硬脂酸（98%，英國(guó)Alfa Aesar 公司），月桂酸、亞油酸（99%，美國(guó)Acros Organics 公司），氫氧化鉀、鹽酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司），其余所用試劑均為色譜純。煙葉樣品： 不同等級(jí)（C2F，B2F，X2F，X3F，C3F）烤煙樣品來(lái)自云南梁河。

（2）儀器：Symbiosis Pico高效液相色譜儀（荷蘭Spark公司），4000 Q Trap質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司），Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司），AL204-IC型電子分析天平（0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取7種高級(jí)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解定容至50 mL，制得0.20 mg/mL單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用甲醇準(zhǔn)確配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（月桂酸：1.0 μg/mL；肉豆蔻酸：2.0 μg/mL；棕櫚酸：50 μg/mL；硬脂酸：10 μg/mL；亞麻酸：60 μg/mL；亞油酸：42 μg/mL；油酸：20 μg/mL）儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中。

準(zhǔn)確配制十七烷酸（0.20 mg/mL）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取一定量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋定容，制得內(nèi)標(biāo)工作液（10 μg/mL）。

1.3 樣品處理與分析

稱取樣品0.5 g于100 mL 圓底燒瓶中，加入40 mL含3 mol/L KOH的甲醇溶液，于60℃水浴中回流皂化60 min，冷卻至室溫。過(guò)濾溶液至錐形瓶中，加入20 mL水，混勻，用36%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH值至3.0 ～ 4.0。用含內(nèi)標(biāo)的二氯甲烷溶液萃取3次，每次15 mL，合并二氯甲烷層，以30 mL超純水反萃取有機(jī)相，將有機(jī)相用氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，移取0.2 mL上述甲醇溶液稀釋至10 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

色譜條件：Hypersil Gold C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流動(dòng)相 A：5%(ν/ν)緩沖溶液的水溶液；流動(dòng)相 B：5%(ν/ν)緩沖溶液、55%(ν/ν)乙腈、40%(ν/ν)異丙醇。緩沖溶液配制：用濃氨水調(diào)節(jié)100 mM冰醋酸至pH=5。運(yùn)行時(shí)間30 min，柱溫20℃，進(jìn)樣體積 5 μL。梯度洗脫條件：0 ～ 20 min，70%B～100% B；保持 5 min；25～30 min，100% B～70% B，流速為0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：-4000 V；氣簾氣：10 psi；掃描時(shí)間：0.1 s；離子源輔助氣1：50 psi；離子源輔助氣2：50 psi；檢測(cè)方式：“準(zhǔn)分子”多反應(yīng)監(jiān)測(cè)過(guò)渡（即采用相同的離子作為母離子和子離子）。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的建立

LC-MS/MS定量測(cè)定高級(jí)脂肪酸常用檢測(cè)模式有MRM[15]（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）和SIM[16-17]（選擇離子掃描）模式。MRM模式分析高級(jí)脂肪酸雖然可以減少煙草中基質(zhì)干擾，但分析物在負(fù)離子模式下，加碰撞能產(chǎn)生的碎片離子靈敏度很低，無(wú)法滿足定量條件的要求。SIM模式比MRM模式在高級(jí)脂肪酸分析中有更好的靈敏度，但對(duì)于煙草樣品會(huì)有更多的分析干擾?！皽?zhǔn)分子”MRM過(guò)渡模式是采用相同的離子作為母離子和子離子，既解決了分析干擾因素又提高了分析靈敏度。本文比較了以上3種檢測(cè)模式，結(jié)果如表1所示。從表1可知，“準(zhǔn)分子”MRM過(guò)渡模式響應(yīng)值高于MRM模式，與SIM模式相比，大部分目標(biāo)物響應(yīng)值略高。因此，本文采用“準(zhǔn)分子”MRM過(guò)渡模式。

表1 “準(zhǔn)分子”MRM過(guò)渡、SIM和MRM模式對(duì)比Tab.1 Comparison of the MRM, SIM and “Pseudo-molecular” MRM transition mode

2.2 離子源優(yōu)化

本文分別采用ESI源和APCI源進(jìn)行離子源優(yōu)化。由圖1可以看出，除棕櫚酸外，其它被測(cè)物的ESI源信號(hào)強(qiáng)度均高于APCI源，因此本文采用ESI源。

圖1 對(duì)比使用ESI和APCI接口目標(biāo)化合物的靈敏度Fig. 1 Sensitivity of the target compounds using the ESI and APCI interfaces

采用負(fù)離子模式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，從而確定母離子。然后對(duì)各質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高靈敏度使得信號(hào)穩(wěn)定。最終確定質(zhì)譜最佳檢測(cè)條件，各化合物的優(yōu)化結(jié)果如表2所示。

表2 質(zhì)譜優(yōu)化條件Tab.2 Investigated compounds with their specific MS/MS parameters

2.3 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水，乙腈-水，緩沖溶液的水溶液-乙腈/異丙醇/緩沖液體系作流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響。結(jié)果如圖2所示，乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，峰型較差，響應(yīng)較低；甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)的峰型較好，響應(yīng)較高，干擾峰較少，但目標(biāo)物不能有效分離。改用A相為5%緩沖溶液的水溶液，B相為5%緩沖溶液、55%乙腈、45%異丙醇作流動(dòng)相。加入緩沖鹽溶液調(diào)節(jié)溶液pH值高于pKa使得脂肪酸易脫質(zhì)子產(chǎn)生負(fù)離子，加入異丙醇后調(diào)節(jié)有機(jī)相極性，實(shí)現(xiàn)了各目標(biāo)物完全分離，且具有較好的方法靈敏度。因此選用此條件作為流動(dòng)相分析條件。

2.4 前處理過(guò)程的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，選擇甲醇作皂化溶劑，分別對(duì)氫氧化鉀濃度，皂化溫度，反應(yīng)時(shí)間，萃取劑提取效率和萃取劑體積進(jìn)行優(yōu)化?？疾炝嗽砘瘻囟确謩e為40，50，60和70℃時(shí)對(duì)各化合物測(cè)定值的影響。結(jié)果表明，當(dāng)皂化溫度從40℃增加到60℃時(shí)，各物質(zhì)的測(cè)定值顯著增加，繼續(xù)升高溫度，各物質(zhì)含量變化趨于平緩。因此選擇皂化溫度為60℃。分別比較了反應(yīng)時(shí)間為20，40，60和80 min時(shí)的各化合物測(cè)定值。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，各化合物測(cè)定值逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從60 min增加到80 min時(shí)，各物質(zhì)測(cè)定值變化不大。表明反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)皂化反應(yīng)進(jìn)行完全。因此選擇反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖2 三種流動(dòng)相對(duì)比圖。a b c分別為甲醇-水，乙腈-水，緩沖溶液的水溶液-緩沖溶液/乙腈/異丙醇作流動(dòng)相，a b c為硬脂酸色譜圖，d e f為油酸色譜圖Fig. 2 Comparison of LC-MS/MS chromatograms of three mobile phases a MeOH-H2O, b MeCN-H2O, and c buffer/H2O(5/95)-buffer/MeCN/IPA(5/55/40); a b c Stearic acid chromatogram, d e f Oleic acid chromatogram

2.4.1 氫氧化鉀濃度的選擇

分別用1、2、3、4 mol/L KOH的甲醇溶液進(jìn)行皂化實(shí)驗(yàn)（表3）。結(jié)果顯示KOH的甲醇溶液濃度由1 mol/L上升到3 mol/L 時(shí)，高級(jí)脂肪酸的測(cè)定值顯著增大，隨后趨于平緩。因此本文選用3 mol/L KOH的甲醇溶液作皂化溶劑。

表3 不同濃度KOH的甲醇溶液下各高級(jí)脂肪酸的測(cè)定值Tab.3 Effect of KOH-CH3OH concentration on high fatty acids mg/g

2.4.2 萃取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取了環(huán)己烷、無(wú)水乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷作為萃取液優(yōu)化高級(jí)脂肪酸萃取條件，發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醚和乙酸乙酯不能與水相較好地分層，因此比較了環(huán)己烷、二氯甲烷、正己烷對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響。為防止環(huán)己烷、二氯甲烷、正己烷溶劑和流動(dòng)相不匹配，將萃取液用氮?dú)獯蹈珊笥眉状级ㄈ?，在相同條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)于肉豆蔻酸和亞油酸，環(huán)己烷萃取效率略高，但其他化合物二氯甲烷萃取效率最高，因此最終選用二氯甲烷為萃取溶劑。

圖3 不同提取試劑對(duì)各高級(jí)脂肪酸的影響Fig.3 Effect of extraction reagents on high fatty acids

2.4.3 萃取溶劑體積選擇

固定樣品量為0.5 g，分別比較了萃取溶劑體積為10、12、15、18 mL時(shí)的萃取效率（表4）。結(jié)果表明，隨著萃取溶劑增加，提取出的被測(cè)物含量逐漸增加。當(dāng)萃取溶劑達(dá)到15 mL時(shí)萃取基本完全。因此使用萃取溶劑體積為15 mL。

表4 不同體積萃取溶劑下各高級(jí)脂肪酸的測(cè)定值Tab.4 Effect of Extraction Solvents Volume on high fatty acids mg/g

2.5 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及回收率

準(zhǔn)確配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3所述條件進(jìn)行LC-MS/MS分析，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子流圖如圖4所示。內(nèi)標(biāo)法線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、LOQ（表5）。各目標(biāo)化合物具有良好的相關(guān)性，適合定量分析。將最小濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣10次得到標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法的檢測(cè)限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。各物質(zhì)的LOD范圍為0.0004～0.007 mg/g，LOQ范圍為0.001～0.02 mg/g。在空白樣品中添加7種高級(jí)脂肪酸混合標(biāo)樣，添加濃度0.02～1.2 mg/g之間，重復(fù)進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，得出平均回收率為87.5%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 1.1%～4.7%之間（表5）。

圖4 混合標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)選擇離子流色譜圖Fig.4 Chromatogram of mixed standard and internal standard

2.6 本方法與氣質(zhì)方法比較

分別采用GC-MS[11]和LC-MS/MS法測(cè)定高級(jí)脂肪酸（表6）。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，說(shuō)明兩種方法均具有良好的線性關(guān)系。LC-MS/MS靈敏度優(yōu)于GC-MS，但回收率和精密度略差于GC-MS，兩種方法均滿足定量分析要求。高級(jí)脂肪酸屬于低揮發(fā)性物質(zhì)，因此不適合直接進(jìn)行GC-MS分析，需進(jìn)行衍生化，反應(yīng)時(shí)間2 h，衍生化副產(chǎn)物較多，有時(shí)可干擾目標(biāo)物的檢出，且無(wú)法分別定量亞麻酸和油酸。而LC-MS/MS法皂化后直接測(cè)定，無(wú)需衍生化，減少樣品用量，分離時(shí)間快且有效縮短檢測(cè)時(shí)間。

對(duì)于高級(jí)脂肪酸含量測(cè)定，本方法是通過(guò)皂化使煙草中酯結(jié)合態(tài)脂肪酸轉(zhuǎn)化為游離態(tài)脂肪酸，經(jīng)提取得到煙草中總的脂肪酸含量；而GC-MS方法是通過(guò)酯化使游離態(tài)脂肪酸轉(zhuǎn)化為酯結(jié)合態(tài)脂肪酸，經(jīng)提取后得到總的脂肪酸含量。比較上述兩種方法對(duì)煙草樣品進(jìn)行分析（表7）。由表7可知，兩種方法測(cè)定樣品均未檢出月桂酸，不同烤煙中高級(jí)脂肪酸含量存在一定差異。本文方法測(cè)定樣品中高級(jí)脂肪酸含量分別為：肉豆蔻酸（0.018～0.073 mg/g）、棕櫚酸(1.43～1. 87 mg/g)、硬脂酸(0. 24～0. 55 mg/g)、亞麻酸(2.17～2.99 mg/g)、亞油酸(0.56～1.28 mg/g)、油酸(0. 43～0. 86 mg/g)。氣質(zhì)測(cè)定結(jié)果為肉豆蔻酸（0.019～0.055 mg/g）、棕櫚酸(1.63～2.19 mg/g)、硬脂酸(0.37～0.46 mg/g)、亞油酸(1.12～1.64 mg/g)、亞麻酸+油酸(2.55～3.78 mg/g)。總體看來(lái)，對(duì)于肉豆蔻酸，液質(zhì)方法測(cè)定含量高于氣質(zhì)方法，其他化合物氣質(zhì)測(cè)定含量高于液質(zhì)。

表5 7種高級(jí)脂肪酸的相關(guān)參數(shù)Tab.5 Quality parameters of 7 high fatty acids

表6 比較2種高級(jí)脂肪酸的測(cè)定方法Tab.6 Comparison of two methods for the determination of high fatty acids

表7 比較2種方法測(cè)定煙草樣品中高級(jí)脂肪酸含量Tab.7 Comparison of two methods for the determination of high fatty acids in tobacco mg/g

3 結(jié)論

建立了一種高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定煙草中高級(jí)脂肪酸含量的方法。該法快速、準(zhǔn)確，具有精密度高、準(zhǔn)確度好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，避免了衍生化處理對(duì)樣品造成損失的問(wèn)題，滿足煙草中高級(jí)脂肪酸定量分析。