煙草種質(zhì)的SSR標(biāo)記遺傳多樣性及青枯病抗性的關(guān)聯(lián)分析

賴瑞強(qiáng)，李榮華，夏巖石，郭培國*，袁清華，趙偉才

1 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510006；

2 廣東省農(nóng)科院作物研究所 廣州 510640；

3 廣東省煙草南雄科學(xué)研究所 廣東南雄 512400

草青枯病是煙草生產(chǎn)中的一大毀滅性病害，主要發(fā)生在我國南方煙區(qū)。隨著全球溫室效應(yīng)現(xiàn)象的加劇，高溫高濕的情況越發(fā)嚴(yán)重，造成煙草發(fā)病率普遍提高，且該病害有向北蔓延擴(kuò)展的趨勢[1]。研究表明，煙草青枯病抗性為受多基因控制的數(shù)量性狀，易受到基因型與環(huán)境交互作用的影響，使得培育青枯病抗病品種的任務(wù)更加嚴(yán)峻[2]。與傳統(tǒng)青枯病抗病品種的選育方法相比，基于分子標(biāo)記建立的輔助選擇技術(shù)具有減少環(huán)境互作的影響、提高篩選效率等優(yōu)點(diǎn)，可加速青枯病抗病品種的選育進(jìn)程[2-3]。

基于家系群體開展連鎖作圖的QTL定位分析和基于連鎖不平衡利用自然群體開展的關(guān)聯(lián)分析是發(fā)掘與目標(biāo)性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的主要方法。Nishi等[4]首次利用連鎖分析發(fā)現(xiàn)1個與青枯病抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)，隨后Qian等[2]、Lan等[5]和袁清華等[6]利用該方法分別探測到4、8和6個煙草青枯病抗性相關(guān)的QTLs。但由于連鎖分析只限于檢測來自雙親的2個等位變異，適用性較狹窄；而關(guān)聯(lián)分析利用自然群體材料多世代的重組事件，能克服連鎖分析存在的不足，具有較大的潛力發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性狀所牽涉到的多基因及相互關(guān)系[7]。使用關(guān)聯(lián)分析方法，張吉順等[8]和童治軍等[9]成功發(fā)現(xiàn)了煙草一些農(nóng)藝性狀相關(guān)的等位基因，童治軍等[9]、余義文等[10]、任民等[11]和樊文強(qiáng)等[12]在煙草一些化學(xué)成分研究中亦取得一些成績；但煙草煙草青枯病抗性關(guān)聯(lián)分析的研究較少，僅見吳超等[3]利用MFLP和SSR標(biāo)記開展煙草青枯病抗性關(guān)聯(lián)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)到 6個MFLP標(biāo)記位點(diǎn)與煙草青枯病抗性顯著相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)有SSR標(biāo)記位點(diǎn)與煙草青枯病抗性相關(guān)。眾所周知，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好和呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)[13-14]；且其操作和檢測也較為簡單，只需通過PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]。

群體結(jié)構(gòu)分析是開展關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)。在煙草群體結(jié)構(gòu)分析研究中，張吉順等[16]利用16對SRAP引物將276份煙草種質(zhì)劃分為7個亞群，而童治軍等[9]和樊文強(qiáng)等[12]利用SSR標(biāo)記分別將96份和231份煙草種質(zhì)劃分為3個亞群；然而基因組內(nèi)存在多個分子標(biāo)記緊密連鎖的不平衡區(qū)域[17]，將這些區(qū)域當(dāng)做一個遺傳標(biāo)記（即一個單倍型）進(jìn)行研究，可減少研究的位點(diǎn)數(shù)[17-18]；而且通過構(gòu)建單倍型，可將存在強(qiáng)連鎖不平衡的幾個位點(diǎn)當(dāng)作一個超位點(diǎn)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析，對性狀的檢測效能要比單標(biāo)記高[19-20]。

據(jù)此，本研究利用SSR分子標(biāo)記對94份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，獲悉煙草種質(zhì)材料間的遺傳差異和進(jìn)行單倍型的構(gòu)建；在分析這些種質(zhì)材料群體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，開展煙草青枯病抗性的關(guān)聯(lián)分析；研究結(jié)果可為煙草種質(zhì)的合理利用及青枯病抗病材料的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

94份煙草種質(zhì)材料來源于美國、日本、加拿大、索馬里、澳大利亞、津巴布韋以及中國等地，包括烤煙、曬煙和白肋煙3種類型，由廣東省煙草南雄科學(xué)研究所提供，其詳細(xì)信息見表1。

表1 94份煙草種質(zhì)材料的來源與類型Tab.1 The origins and types of 94 tobacco germplasm materials

續(xù)表1

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在2013年3月9日和2014年2月29日移栽種植供試的94份煙草種質(zhì)材料于廣東省南雄煙草研究所試驗(yàn)田青枯病病圃，每份種質(zhì)種植20株，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，按常規(guī)方法栽培管理，以“巖煙97”和“紅花大金元”分別作為抗病和感病對照品種。

1.3 青枯病病情調(diào)查

2013年5月8日和2014年5月4日使用莖部穿刺接種法[34]對處于旺長期的煙草進(jìn)行人工注射基部莖桿接種致病型小種1、生化型III的青枯病病菌。2013年5月30日和2014年5月29日進(jìn)行病情等級調(diào)查，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照《GB/T23222-2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》。并根據(jù)煙草病害等級計(jì)算病情指數(shù)（病指，Disease index，DI）[35]。

病指=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100

據(jù)此，以《YC/T 41-1996煙草品種抗病性鑒定》的標(biāo)準(zhǔn)方法來劃分94份種質(zhì)的抗病性。

1.4 SSR分子標(biāo)記技術(shù)

采取各種質(zhì)材料的幼嫩葉片，使用改良的CTAB法[36]提取這些材料的DNA；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量、使用NanoDrop紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，并將所提取DNA稀釋至20 ng·L-1，作為SSR擴(kuò)增模板。

根據(jù)業(yè)已報(bào)道的煙草SSR引物等信息[37-41]，從中篩選出在“巖煙97”、“紅花大金元”、“118-3”和“粵煙98”四個材料中擴(kuò)增條帶清晰易辨、特異性良好且具有多態(tài)性的236對SSR引物（見網(wǎng)絡(luò)版補(bǔ)充材料附表1）用于本研究。

SSR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括DNA模板2μL，1μmol·L-1正向引物0.3μL，1 μmol·L-1反向引物0.3 μL，25 mmol · L-1MgCl20.8μL，Taq DNA Polymerase （5 U · μL-1）0.1 μL，10×PCR Buffer 1 μL，10 mmol · L-1dNTPs0.3 μL，雙蒸水5.2μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性 5 min，接著以94℃ 45s、相應(yīng)引物退火溫度45s和72℃ 1min，循環(huán)38次；最后72℃充分延伸10 min。采用6%非變性聚丙烯酰胺膠電泳和銀染法[42-43]檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所用試劑均購自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用BenQ M800掃描儀掃描凝膠電泳圖譜，通過GelBuddy軟件[44]判讀凝膠電泳圖譜中的條帶，根據(jù)條帶的有無，確定等位變異位點(diǎn)，并構(gòu)建1、0二元數(shù)據(jù)矩陣。SSR變異位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（Polymorphism Information Content，PIC） 的 計(jì) 算方法為PIC=1-∑Pa2，式中Pa表示出現(xiàn)第a個等位變異的頻率[14]。利用Haploview軟件[45]，將SSR標(biāo)記的等位變異位點(diǎn)1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為“1”和“2”并制成數(shù)矩陣，選擇該軟件中的“Haps format”程序，并設(shè)置條件參數(shù)為位點(diǎn)間距小于500kb，缺失率低于50%，利用子程序“LD Plot”進(jìn)行位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析，選擇滿足位點(diǎn)間連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)r2值大于0.8的強(qiáng)連鎖區(qū)域，接著利用子程序“Haplotypes”構(gòu)建單倍型。運(yùn)用POPGENEVersion1.31軟件計(jì)算煙草材料間的遺傳一致度。運(yùn)用Structure2.3軟件對94份煙草種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，估計(jì)最佳的群體類群數(shù)K；設(shè)定K取值范圍為1-11，觀察隨K值增加后驗(yàn)概率值LnP(D)的變化拐點(diǎn)來確定K值，如LnP(D)持續(xù)增加未出現(xiàn)拐點(diǎn)，則參照Evanno等[46]的方法以△K的最大值來確定K值并獲取相應(yīng)的群體矯正系數(shù)Q值。運(yùn)用SPAGeDi1.3d軟件[47]獲取煙草種質(zhì)間的親緣系數(shù)，并將其中所有負(fù)值設(shè)為0，制成矩陣和Q值一起作為協(xié)變量進(jìn)行群體矯正，再利用TASSEL3.0的混合線性模型（Mixed Linear Model，MLM）進(jìn)行青枯病關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病病情統(tǒng)計(jì)及分析

2013年和2014年94份煙草自然群體青枯病病情調(diào)查結(jié)果見表2。從表中可見，94份材料兩年間抗性評價(jià)一致的種質(zhì)共59份，占總種質(zhì)的62.77%，如“TI245”和“C206”、“C316” 等兩年均表現(xiàn)出中抗（MR：25＜DI≤50）或高抗（HR：0＜DI≤25）青枯病，而“MC944”、“湖口煙”和“KE1”等兩年均表現(xiàn)出中感（MS：50＜DI≤75）或高感（HS∶75＜DI≤100）青枯??；經(jīng)pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩年病指相關(guān)系數(shù)（PS）為0.691，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。表明供試煙草種質(zhì)兩年間的抗病程度較為穩(wěn)定。且2013年和2014年青枯病病指統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表3）表明，病指變幅大，變異系數(shù)均較大，分別為89.69%和91.61%。表明94份煙草種質(zhì)對青枯病的抗性變異較大，適合開展煙草青枯病抗性關(guān)聯(lián)分析。

表2 供試煙草種質(zhì)青枯病病情指數(shù)與抗性評價(jià)Tab.2 Bacterial wilt disease index of selected tobacco germplasm materials and resistance evaluation

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

表3 供試煙草種質(zhì)青枯病病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 Statistic data of bacterial wilt disease index of selected tobacco germplasm materials

2.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

使用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法檢測各個SSR標(biāo)記在94份種質(zhì)材料中存在的等位位點(diǎn)（圖1），236對SSR引物共檢測到904個等位變異位點(diǎn)，各引物變異位點(diǎn)數(shù)目變化范圍為1～8，平均變異位點(diǎn)數(shù)為3.83；數(shù)據(jù)分析表明SSR標(biāo)記的PIC值變幅為0.1361～0.8760，平均為0.5136。表明這些引物具有較高的多態(tài)性信息，能在一定程度上反映煙草種質(zhì)蘊(yùn)藏的豐富基因信息。

2.3 基因多樣性及親緣關(guān)系分析

基因多樣性是生物多樣性的重要組成部分，對其研究有利于保護(hù)、開發(fā)和利用種質(zhì)資源[48]?；?04個SSR標(biāo)記位點(diǎn)，通過SPAGeDi1.3d軟件計(jì)算可知94份煙草種質(zhì)兩兩組合為4371個，其親緣系數(shù)小于0.05的組合占總組合的72.41%，且親緣系數(shù)為0的組合占了57.52%，表明大多數(shù)供試種質(zhì)間親緣關(guān)系弱或無親緣關(guān)系。遺傳一致度檢測發(fā)現(xiàn)94份煙草材料的基因多樣性指數(shù)為0.5405，即該群體隨機(jī)抽取兩個等位基因?yàn)殡s合的概率均超過50%，表明所選種質(zhì)的基因多樣性較為豐富。

圖1 SSR標(biāo)記TM10788在94份煙草種質(zhì)材料擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染圖Fig.1 Silver staining image of polyacrylamide gel electorphoresis of SSR marker TM10788 in amplification products of 94 tobacco germplasm materials

2.4 單倍型的構(gòu)建及群體結(jié)構(gòu)分析

連鎖不平衡分析中r2值是反映兩個位點(diǎn)之間的相關(guān)系數(shù)，與關(guān)聯(lián)分析的效力密切相關(guān)[49]。在本研究中，利用Phillips等[50]的連鎖不平衡法對904個SSR位點(diǎn)進(jìn)行單倍型的構(gòu)建，選取r2值作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，在r2大于0.8的強(qiáng)連鎖不平衡條件下構(gòu)建了61個單倍型塊（D1～D61），這些單倍型塊中含有126個單倍型（Hap1～126），且每個單倍型出現(xiàn)的頻率均高于0.05。

基于126個單倍型，進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。設(shè)定類群數(shù)目K的取值范圍為1～11，將MCMC（Markov Chain Monte Carlo）的不作數(shù)迭代（Length of burn in period）設(shè)為100000，對每個K值進(jìn)行10次運(yùn)算，獲取后驗(yàn)概率值LnP(D)，分析發(fā)現(xiàn)，隨著K值的上升，后驗(yàn)概率LnP(D)表現(xiàn)出持續(xù)攀升的趨勢而未出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)（圖2A），難以確定該群體的類群數(shù)；在此情況上，依照Evanno等[46]認(rèn)為最大△K值時(shí)的K值即為最佳類群數(shù)的原則，分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)△K值達(dá)到最大時(shí)對應(yīng)的K值為2（圖2B），表明該群體劃分的最佳類群數(shù)為2，即類群Ⅰ和類群Ⅱ。

圖2 K值與LnP(D)值（A）和△K值（B）的變化分布圖Fig.2 Change distribution of K value with LnP(D) value (A) and△K value (B)

構(gòu)建的群體結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。從中可見，類群Ⅰ由38份均為烤煙的煙草種質(zhì)組成，這些種質(zhì)來自美國26份，廣東5份，云南3份，山東、福建、貴州和湖南各1份；類群Ⅱ包含56份煙草種質(zhì)，由52份烤煙、2份廣東曬煙和2份美國白肋煙組成，烤煙分別來源于美國24份，廣東11份，山東5份，云南3份，河南2份，福建1份，津巴布韋2份，日本、索馬里、加拿大和澳大利亞各1份。不同來源的材料在每個類群中均有分布，表明品種的類群劃分結(jié)果和地理來源之間沒有必然聯(lián)系，與羅凱等[51]的研究結(jié)果一致。供試群體被分為兩個類群，與前人[3,8,12,16]的研究相比，群體結(jié)構(gòu)較簡單，而相對簡單的群體結(jié)構(gòu)，有利于減少由于群體結(jié)構(gòu)的影響而造成關(guān)聯(lián)分析的假陽性，可提高關(guān)聯(lián)分析的效果[52]。

圖3 94份煙草種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Diagram of population structure of 94 tobacco germplasm materials

2.5 煙草青枯病抗性的關(guān)聯(lián)分析

利用群體結(jié)構(gòu)分析獲得的各個體的矯正系數(shù)Q值和親緣系數(shù)作為協(xié)變量進(jìn)行校正，是避免基因型和表型在關(guān)聯(lián)分析中出現(xiàn)假陽性的有效方式[8,47]。本研究中，根據(jù)基于126個單倍型分析所得的群體結(jié)構(gòu)Q值和親緣系數(shù)，利用Tassel軟件對126個單倍型分別與2013年和2014年青枯病抗病性表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2013年在P＜0.05顯著水平有4個單倍型與青枯病抗病性密切相關(guān)，對青枯病病指的表型變異解釋率在8.19～13.65%之間（表4），其中Hap1、Hap64和Hap126這3個單倍型達(dá)到P＜0.01的極顯著水平，這3個單倍型對青枯病的表型變異解釋率分別為13.65%、、13.56%和14.31%；2014年在P＜0.05顯著水平有7個單倍型與青枯病抗病性密切相關(guān)，對青枯病的表型變異解釋率在 5.14～10.53%之間，其中有1個單倍型Hap62達(dá)到P＜0.01的極顯著水平，其對青枯病表型變異解釋率為10.53%。這樣，兩年共檢測到7個與青枯病抗病性密切相關(guān)的單倍型，其中兩年均檢測到的單倍型為三個，即Hap61、Hap62和Hap64，它們對對青枯病的表型變異解釋率介于8.19～13.56%之間，平均達(dá)10.27%。

表4 與煙草青枯病抗性相關(guān)的單倍型及類型Tab.4 Haplotypes and loci associated with resistance of tobacco bacterial wilt

3 討論

前人研究表明我國抗青枯病的優(yōu)質(zhì)煙草資源匱乏[53]，且目前煙草青枯病抗源主要來自美國品種TI448A[54]，抗源單一，遺傳基礎(chǔ)薄弱，不足以應(yīng)對遺傳多樣性豐富且變異能力強(qiáng)的青枯病菌。因此通過研究煙草的遺傳多樣性，進(jìn)而挖掘和利用其優(yōu)良抗病基因至關(guān)重要。本研究對94份煙草種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)其基因多樣性指數(shù)為0.5405，高于張吉順等[8]、王國平等[55]和王一伊等[56]所選種質(zhì)的基因多樣性指數(shù)。表明供試的關(guān)聯(lián)作圖群體遺傳多樣性較豐富，符合Mackay等[57]提出進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)，需選取遺傳多樣性豐富的群體的理論。另外，從供試種質(zhì)材料青枯病抗性來看，兩年田間鑒定評價(jià)結(jié)果表明種質(zhì)材料間的抗病性差異明顯，多數(shù)與前人研究報(bào)道的抗病性基本一致，如感病材料“紅花大金元”[21-27]和“許金1號”[22]，抗病材料“巖煙97”[22,26-26,32]、“NC60”[26]和“930032”[28]等；部分種質(zhì)與前人鑒定結(jié)果存在差異，如本研究鑒定“K326”為抗病材料，一些研究報(bào)道[3,23-24,28,31]與本研究所得結(jié)果一致，但另一些研究[21,25-27]表明其為感病材料；張振臣等[22]將“C86”鑒定為抗病材料，而本研究將其鑒定為感病材料等。導(dǎo)致鑒定評價(jià)結(jié)果差異的原因可能與接種的青枯病菌類型[25,33,58]、接種方式[59]、接種時(shí)煙草的生育期[59]和接種的菌液濃度[59-60]有關(guān)；此外，不同煙草病情等級劃分及抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)[3,21-33]亦導(dǎo)致不同的評價(jià)結(jié)果。但本研究所有種質(zhì)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)具有統(tǒng)一性，種質(zhì)間病指的差異主要來源于自身的抗性能力，且兩年間的病指存在顯著相關(guān)，煙草種質(zhì)抗性鑒定一致性比例大于60%，表明本研究病指可靠，抗性鑒定結(jié)果具有一定的參考價(jià)值，利用該病情指數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析可靠性高。

地理環(huán)境的差異和自然選擇壓力的存在導(dǎo)致不同來源的材料間存在一定的群體結(jié)構(gòu)，繼而造成群體內(nèi)出現(xiàn)多個類群的情況。本研究對94份煙草種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，將該群體劃分為2個類群，群體結(jié)構(gòu)較簡單，每個類群均包含不同地理來源的煙草種質(zhì)，表明不同地理來源的種質(zhì)在群體結(jié)構(gòu)上的分化不明顯，與前人[51]的研究結(jié)果一致；發(fā)現(xiàn)來源地相同的煙草材料并不能完全聚在一起，部分美國烤煙和中國的烤煙被歸在同一類群，而中國不同省份的烤煙在相同的類群中均有分布，曬煙和白肋煙被歸為一類，該研究結(jié)果符合吳超等[3]和劉文杰等[61]的研究結(jié)果。說明本研究的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可靠，由此獲得的矯正系數(shù)Q值可信度高，可以用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析，以減少群體結(jié)構(gòu)對關(guān)聯(lián)分析準(zhǔn)確度的干擾。

關(guān)聯(lián)分析利用自然群體材料多世代的重組事件，有利于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性狀與分子標(biāo)記間的關(guān)系。然而煙草青枯病受微效多基因控制，大多數(shù)單標(biāo)記的作用往往很小，難以通過嚴(yán)格的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，且染色體上的等位基因間存在不完全的連鎖不平衡，導(dǎo)致利用單標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)，僅有少數(shù)單標(biāo)記與性狀顯著關(guān)聯(lián)[62]。但基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析，其單倍型由多個單標(biāo)記組成，區(qū)組信息和互作信息利用較為充分，能夠克服單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析的局限性，具有更好的檢測效能[63-64]。然而以往研究多采用單標(biāo)記進(jìn)行相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，如童治軍等[9]基于SSR單標(biāo)記對231份烤煙的8個農(nóng)藝性狀和5個化學(xué)成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，僅發(fā)現(xiàn)到9個重要的QTL位點(diǎn)。而如果利用單倍型關(guān)聯(lián)分析，可能會檢測到更多與目的性狀顯著關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)；如任民等[11]基于62個SSR位點(diǎn)對煙草致香物質(zhì)進(jìn)行單標(biāo)記和單倍型的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析中未被關(guān)聯(lián)到的3個單標(biāo)記，在其構(gòu)建為單倍型后被顯著關(guān)聯(lián)，且關(guān)聯(lián)到的致香成分最多。

由于關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)的QTL定位，群體結(jié)構(gòu)的存在會通過影響等位變異位點(diǎn)而影響到關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性，易造成偽關(guān)聯(lián)[65]。因此，在滿足強(qiáng)連鎖不平衡條件下構(gòu)建單倍型并進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，獲取矯正系數(shù)Q值，有利于提高關(guān)聯(lián)分析的可靠性。但僅通過Q值作為矯正條件，并不能完全避免出現(xiàn)假陽性關(guān)聯(lián)。有研究表明，以群體結(jié)構(gòu)Q值和親緣系數(shù)值共同作為協(xié)變量的混合線性模型，即利用MLM_Q+親緣系數(shù)值模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，更有利于提高關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性[8]。據(jù)此，本研究通過這種模型對兩年的青枯病病情指數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，在94份材料中共發(fā)現(xiàn)了7個單倍型（含14個位點(diǎn)）與青枯病抗病性相關(guān)，遠(yuǎn)多于吳超等[3]發(fā)現(xiàn)的6個與青枯病抗性相關(guān)的MFLP標(biāo)記位點(diǎn)。兩年間重復(fù)定到了3個單倍型與青枯病抗性相關(guān)，分別為Hap61、Hap62和Hap64，平均解釋率超過10%，可為煙草青枯病抗病材料的分子標(biāo)記輔助篩選提供參考。與前人[2,4-6]利用連鎖分析發(fā)現(xiàn)煙草青枯病抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)相比，本研究所得的結(jié)果主要有以下特點(diǎn)。首先，本研究利用的供試材料豐富，克服了連鎖分析僅利用兩個親本材料進(jìn)行研究的局限性，所以本研究發(fā)現(xiàn)的與青枯病抗病性相關(guān)的單倍型，其適用的材料較廣泛；其次，本研究作圖精度較高，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的精確定位，而連鎖分析僅是將QTL定位在臨近標(biāo)記之間的區(qū)域；再者，本研究通過構(gòu)建單倍型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得的單倍型包含較豐富的信息。然而，連鎖分析能檢測QTL的加性效應(yīng)，且能克服關(guān)聯(lián)分析對稀有等位基因檢測效能低的缺點(diǎn)[57]；所以在今后的研究中，如果采用連鎖分析結(jié)合關(guān)聯(lián)分析的策略，揚(yáng)長避短，將可提高青枯病抗性QTL分析的效率和準(zhǔn)確性。