基于煙茄嫁接的低煙堿煙草煙葉化學成分變化

任夢娟，史宏志，頓松陽，楊惠娟，李洪亮

1 河南農(nóng)業(yè)大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；2 河南省煙草公司許昌市公司襄城縣分公司，河南許昌 461700

生物堿是煙草屬（Nicotiana）植物的重要化學成分，其中煙堿是普通煙草屬最主要的生物堿，約占總生物堿的90%以上[1]。煙葉在燃吸過程中釋放的煙堿通過血液進入腦細胞，使人產(chǎn)生生理反應，因此，被認為是煙葉中主要的活性成分，不僅影響煙葉的勁頭，也是使人產(chǎn)生致癮性的主要成分[2-3]。Benowitz等于1994年首先提出把煙葉煙堿含量降低到使人致癮的臨界值以下可有效減少吸煙者對煙草的依賴性的理念[4]。美國食品和藥物管理局宣布，正考慮強制降低可燃香煙中的煙堿含量至不使人致癮的水平[5]。世界衛(wèi)生組織為了降低吸煙率，建議將卷煙煙絲中的煙堿含量降至0.4mg/g以下[6]，煙堿含量在0.2至0.3mg/g之間，低于維持上癮所需的閾值[4]。因此，低煙堿煙葉生產(chǎn)技術的可行性和對煙葉品質(zhì)及消費者感受的影響成為近幾年國際煙草界的研究熱點。煙葉的煙堿含量從根本上來說受遺傳因素控制，但也受到生態(tài)、農(nóng)藝等措施的強烈影響。目前降低煙葉煙堿含量的技術手段包括常規(guī)育種、化學和農(nóng)藝調(diào)控、遺傳工程及工業(yè)方法等。其中常規(guī)育種降低煙堿含量的潛力較小；化學和農(nóng)藝調(diào)控對降低煙葉煙堿含量的幅度十分有限，而且煙堿含量的降低往往伴隨著煙葉質(zhì)量和可用性的顯著下降；Legg等[7]曾于上世紀60年代育成了基因型為雙隱性的低煙堿品系LAB21，煙堿含量可低至0.3mg/g，其煙葉化學成分與常規(guī)的正常煙堿含量煙葉相比發(fā)生一定的變化[8-9]，；通過分子手段抑制或敲出煙堿合成的關鍵基因可有效降低煙堿合成，使煙葉煙堿含量降至接近零的水平，但鑒于其對品質(zhì)的影響和轉基因煙草應用的限制，難以在實際生產(chǎn)中應用[10-12]；通過工業(yè)處理如超臨界萃取可將煙葉煙堿含量降低至極低水平，但也伴隨有香氣成分減少等不利影響[13]。

嫁接栽培技術已被廣泛應用于瓜果、蔬菜種植上，能夠提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高植物抗性、促進養(yǎng)分吸收等[14-15]。嫁接可延緩煙草青枯病的發(fā)生，降低發(fā)病率和病情指數(shù)，提高煙株的產(chǎn)量、產(chǎn)值和均價[16]。早在1942年Dawson證明了煙草煙堿的合成部位位于根部[17]，以煙草為接穗嫁接到茄子上的嫁接苗青枯病的抗性明顯提高[18]。但以生產(chǎn)可調(diào)制的低煙堿煙葉為目的，以及其對煙葉化學組成變化的影響尚無研究報道。本課題組于2017年以烤煙為接穗，同科的茄子為砧木，成功探索了煙茄種間嫁接技術，并對煙株生長發(fā)育過程中農(nóng)藝性狀和鮮煙葉及烤后煙葉化學成分進行了測定，以明確煙茄嫁接生產(chǎn)無煙堿或低煙堿煙葉和嫁接后通過培土誘發(fā)接穗產(chǎn)生不定根進而調(diào)控煙堿含量的可行性，分析無煙堿或低煙堿煙葉化學成分變化，并對進一步研究對煙葉質(zhì)量和可用性的影響提供技術和原料支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

本試驗于2017年在河南省許昌市襄城縣王洛鎮(zhèn)王洛煙站，試驗材料：以青皮茄子（Solanum melongenaL.）為砧木、烤煙云煙87為接穗，采用盆栽試驗。土壤類型：沙壤土，土和煙草專用育苗基質(zhì)按1∶1重量均勻混合，每盆裝土10kg。供試肥料為煙草育苗專用營養(yǎng)液，氮：磷：鉀為2∶1∶2。

1.2 試驗設計與方法

采用嫁接剪法，選擇長有5～6片真葉且莖部沒有木質(zhì)化的煙苗和茄子苗進行嫁接，利用嫁接剪剪下接穗，取煙草頂端2葉一心或3葉一心作為接穗，砧木距茄子苗根部5cm左右剪切，然后將接穗插入砧木切口中，用拇指和食指輕輕壓平，最后用嫁接夾固定。每個處理組合嫁接40株，嫁接苗進行避光保溫保濕，前3d相對濕度90%左右，之后相對濕度80%左右，3 d之后見光，7 d后進行正常管理，15 d后去掉嫁接夾。試驗嫁接組合：云煙87/云煙87、云煙87/茄子。試驗嫁接苗6月9日移栽，8月8日打頂，嫁接35d后，選10株長勢一致的煙茄嫁接組合進行培土，培土高度超過嫁接口5cm，使煙株莖稈產(chǎn)生不定根。

試驗采用盆栽方式，共設3個處理，處理1：接穗與砧木都為云煙87，用“煙/煙”表示；處理2：云煙87為接穗，茄子為砧木不進行培土，用“煙/茄不培土”表示；處理3：云煙87為接穗，茄子為砧木并對煙株進行培土且培土高度高于嫁接口5 cm，用“煙/茄培土”表示。每個處理選擇10株，3次重復，共90株嫁接煙株。

鮮煙樣（殺青樣）：分別在嫁接后65d、80d，取各處理中部葉（第12片葉），待烘箱溫度至105℃時，將煙葉放入烘箱殺青15min左右，然后50℃烘干，經(jīng)研磨后過60目篩用于化學成分測定。

烤后樣：煙葉正常成熟采收，各處理選取中部（第7～14葉位）、上部（第15～20葉位），編竿后掛牌標記，采用三段式烘烤工藝烘烤。50℃烘干、研磨，過60目篩，用于化學成分測定。

1.3 測試項目和方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀測定

每個處理分別在嫁接后50d、65d、80d選擇5 株有代表性的煙株，測量其株高、莖圍、節(jié)距、葉片數(shù)及最大葉長和葉寬。

1.3.2 鮮煙葉色素的測定

分別在嫁接后65d、80d選取煙株中部葉（第12片葉），剔除主脈和第一支脈，用剪刀剪成1mm×1mm的小塊，用分析天平秤取樣品約0.2g，放入容量瓶內(nèi)，用95%的乙醇定容至25mL，放入黑暗處浸提24h至葉片完全變成白色，然后以95%的乙醇為空白，用分光光度計分別測定提取液在470nm, 649nm和665nm處的吸光度，根據(jù)Arnon法計算各類色素的含量。每個處理做3次重復。

計算公式[19]：

葉綠素a：Ca(mg/L)=13.95A665-6.88A649

葉綠素b：Cb(mg/L)=24.96A649-7.32A665

類胡蘿卜素：Cx.c(mg/L)=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

色素含量（mg/g）= 濃度（mg/L）×提取液總量（L）/樣重（g）

總葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素a+葉綠素b

1.3.3 鮮煙葉及烤后煙生物堿的測定

在堿性條件下，用甲基叔丁基醚 (MTBE) 提取200 mg 樣品的生物堿，以正十六烷為內(nèi)標，通過氣相色譜 - 氫火焰離子化檢測器 (GC-FID) (Agilent 7890A, Agilent Technologies, USA) 定量檢測煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿4 種生物堿的含量。

1.3.4 烤后煙及鮮煙葉常規(guī)化學成分測定

總糖：參照YC/T159—2002；還原糖：參照YC/T216—2007；蛋白質(zhì)：參照YC/T249—2008；淀粉：YC/T216—2013；總氮：參照YC/T161—2002。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和SSPS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 煙茄嫁接對煙株農(nóng)藝性狀的影響

如表 1所示。嫁接后50d，各處理的株高、莖圍、節(jié)距、葉片數(shù)、最大葉長、葉寬差異不顯著，且葉片數(shù)、最大葉長、葉寬均以煙/茄不培土處理最大，煙/茄不培土與煙/茄培土處理的莖圍均高于對照煙/煙處理。嫁接后65d，各處理葉片數(shù)、最大葉長和葉寬均存在顯著性差異，各處理間株高、莖圍、節(jié)距差異不顯著。嫁接后80d各處理間莖圍、最大葉長和葉寬均存在顯著性差異，以煙/茄培土處理最大，對照煙/煙處理最小，各處理株高、節(jié)距、葉片數(shù)差異不顯著。結果表明，煙茄嫁接后煙株形態(tài)特征、長勢長相未發(fā)生顯著改變，表明形態(tài)建成受根系影響較小。

表1 煙茄嫁接對烤煙煙株農(nóng)藝性狀的影響Tab.1 Effect of tobacco and eggplant grafting on agronomic characters of flue-cured tobacco

2.2 煙茄嫁接對鮮煙葉色素含量的影響

如表 2所示。嫁接后65d，各處理葉綠素a和類胡蘿卜素含量差異不顯著，煙/茄不培土和煙/茄培土的葉綠素b和葉綠素總量均顯著高于煙/煙，其中葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總量以煙/茄不培土處理最高，煙/煙的類胡蘿卜素含量最高。嫁接后80d，各處理葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量以及葉綠素總量均存在顯著性差異，其中葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總量均以煙/茄不培土處理最高，且與對照煙/煙處理存在顯著性差異，類胡蘿卜素含量以對照煙/煙嫁接煙株最高，且與煙/茄不培土、煙/茄培土處理存在顯著性差異，煙/茄不培土、煙/茄培土之間差異不顯著，說明煙茄嫁接條件下，煙株后期葉片葉綠素含量下降緩慢，但類胡蘿卜素含量降低明顯，葉綠素與類胡蘿卜素比值增加。外觀表現(xiàn)為嫁接煙株煙葉成熟落黃顯著滯后于對照煙株。

表2 煙茄嫁接對鮮煙葉色素含量的影響Tab.2 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of pigment in fresh tobacco

2.3 煙茄嫁接對煙葉生物堿含量的影響

2.3.1 煙茄嫁接對鮮煙葉生物堿含量的影響

如表3所示。嫁接后65d，各處理的煙堿、假木賊堿、生物堿總量均存在顯著性差異，煙/茄不培土和煙/茄培土煙堿、總生物堿含量顯著低于煙/煙，煙/茄不培土的煙堿和總生物堿含量分別為0.0834%、0.0883%，煙/茄不培土與煙/茄培土處理煙堿占總生物堿的比例較煙/煙有所增加；煙/茄不培土與煙/茄培土處理的假木賊堿含量差異不顯著，均顯著低于煙/煙處理，占總生物堿的比例分別高達5.55%、3.28%，煙/茄不培土和煙/茄培土的生物堿總量分別比煙/煙降低83.70%、72.97%。嫁接后80d，各處理煙堿、假木賊堿含量及生物堿總量存在顯著性差異，煙/煙處理較高，煙/茄不培土處理較低，低至0.0804%，其中除假木賊堿外，生物堿含量的變化與嫁接后65d變化規(guī)律一致，煙/茄不培土與煙/茄培土處理的煙堿和假木賊堿占總生物堿的比例有所增加，煙/茄不培土和煙/茄培土的生物堿總量分別比煙/煙降低88.11%、78.06%。綜上所述，煙/茄培土與煙/茄不培土處理生物堿含量偏低，以煙/茄不培土處理最低。表明，煙茄嫁接可顯著降低煙葉生物堿含量，增加假木賊堿占總生物堿的比例。

表3 煙茄嫁接對鮮煙葉生物堿含量的影響Tab.3 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in fresh tobacco

2.3.2 煙茄嫁接對烤后煙葉生物堿含量的影響

由表4知。上部葉，各處理的煙堿、假木賊堿、降煙堿、新煙草堿含量存在顯著性差異，煙/茄不培土和煙/茄培土處理處理的煙堿、假木賊堿、新煙草堿、降煙堿的含量明顯低于煙/煙，煙/茄不培土的煙堿含量低至0.0999%，比煙/煙降低94.81%，煙/茄培土比煙/煙降低85.75%；煙茄嫁接處理的煙堿占總生物堿的比例大幅下降，降煙堿、假木賊堿、新煙草堿占總生物堿的比例大幅升高；煙/茄不培土和煙/茄培土的生物堿總量均顯著低于煙/煙，分別比對照降低93.56%、83.90%。中部葉，各處理生物堿含量及總生物堿含量變化規(guī)律與上部葉基本一致，煙/茄不培土處理的煙堿、降煙堿、新煙草堿含量最低，煙/茄不培土的煙堿含量為0.1068%，比煙/煙降低94.50%，煙/茄培土比煙/煙降低83.50%，煙/茄不培土和煙/茄培土的總生物堿分別比對照降低94.44%、82.17%。結果表明，煙茄嫁接可顯著降低煙葉生物堿含量，降低煙堿占總生物堿的比例，升高降煙堿、假木賊堿、新煙草堿占總生物堿的比例。

表4 煙茄嫁接對烤后煙煙葉生物堿含量的影響Tab.4 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in flue-cured tobacco

2.4 煙茄嫁接對煙葉常規(guī)化學成分的影響

2.4.1 煙茄嫁接對鮮煙葉常規(guī)化學成分含量的影響

如表5所示。嫁接后65d，不同處理總氮、總糖、還原糖、煙堿含量差異達顯著水平，煙/茄培土與煙/茄不培土處理間的總氮含量差異不顯著，且均顯著高于煙/煙，煙/茄培土最大；煙/茄培土與煙/茄不培土處理的總糖、還原糖和煙堿含量顯著低于煙/煙，煙/茄不培土的煙堿含量低至0.09%。嫁接后80d，各處理常規(guī)化學成分變化規(guī)律與嫁接后65d一致，煙茄嫁接處理的總氮含量顯著增加，總糖、還原糖和煙堿含量顯著降低，煙/茄不培土的煙堿含量低至0.08%。結果表明，煙茄嫁接后煙葉總氮、總糖、還原糖、煙堿等含量受根系影響較大。

2.4.2 煙茄嫁接對烤后煙葉常規(guī)化學成分的影響

如表6所示。上部葉，煙/茄培土和煙/茄不培土處理煙葉蛋白質(zhì)、總氮、淀粉含量均顯著高于煙/煙，且煙/茄培土和煙/茄不培土兩處理間無顯著性差異，煙堿、總糖、還原糖含量顯著低于煙/煙。煙/茄不培土與煙/煙相比，淀粉增加79.02%，煙堿含量減少95%。中部葉，各處理煙葉常規(guī)化學成分含量變化規(guī)律與上部葉一致，煙/茄不培土與煙/煙相比，淀粉增加55.13%，煙堿含量減少95%。表明通過嫁接生產(chǎn)的低煙堿煙草蛋白質(zhì)、總氮和淀粉含量較高，總糖和還原糖含量較低。

表5 煙茄嫁接對鮮煙葉常規(guī)化學成分的影響Tab.5 Effect of tobacco and eggplant grafting on chemical composition in fresh tobacco

表6 煙茄嫁接對烤后煙常規(guī)化學成分的影響Tab.6 Effect of tobacco and eggplant grafting on chemical composition in flue-curedtobacco

3 討論

煙堿含量高低對煙葉的勁頭、香味和刺激性有顯著影響[1]。通常情況下，烤煙煙堿含量為1.5%～3.5%，在煙葉生產(chǎn)過程中，可通過移栽期、種植密度、打頂和抹杈及留葉數(shù)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、施肥等[20-21]栽培措施直接或間接調(diào)控煙堿的含量，但會對煙草的生長發(fā)育、生理生化代謝、煙葉的化學成分和品質(zhì)造成影響，且煙堿降低幅度較小。煙堿主要在根中合成，因而通過嫁接技術對煙草進行換根，可顯著降低煙堿生物合成，生產(chǎn)無煙堿或極低煙堿水平的煙葉。研究結果表明，嫁接煙草農(nóng)藝性狀、長勢長相和生育特性與對照相近，但煙茄嫁接對煙葉后期色素含量和化學成分含量有一定影響，與對照相比表現(xiàn)為葉綠素、蛋白質(zhì)含量偏高，糖分含量下降，這可能與碳氮分配和碳氮代謝的變化有關，煙茄嫁接后氨基酸不再進入生物堿合成途徑，可能更多地用于蛋白質(zhì)的合成或其它代謝途徑。通過觀察可知，嫁接煙葉后期葉色較深，成熟落黃相對較慢，煙/茄不培土處理淀粉含量偏高，可能是由煙葉成熟度不夠?qū)е碌?，Legg and Collins[7]通過遺傳育種方法獲得的低生物堿品系也存在成熟延遲、成熟不良問題。本試驗中的不培土的煙茄嫁接煙葉仍然檢測到了低含量的煙堿，表明其仍有較弱的煙堿合成能力，這些微量煙堿是來自于茄子或是嫁接部位有待進一步研究。通過培土誘發(fā)了接穗基部產(chǎn)生不定根，煙葉煙堿含量較不培土的嫁接煙顯著增加，表明接穗不定根具有煙堿合成能力，因此通過培土等措施控制不定根的產(chǎn)生，可有效控制煙堿合成，為生產(chǎn)上生產(chǎn)不同煙堿含量煙葉提供技術上的可行性。此外，嫁接煙葉的假木賊堿含量沒有與煙堿含量同步下降，其占總生物堿含量的比例顯著上升，這可能是因為假木賊堿在葉片中有一定的合成能力[22]。嫁接煙葉煙堿含量降至極低的水平，其他常規(guī)化學成分相對差異較小，因此實現(xiàn)了對煙堿含量的選擇性降低，所獲得的極低煙堿含量煙葉對進一步研究煙堿在卷煙化學組成中的作用和對感官質(zhì)量的影響有重要價值。以茄子為砧木嫁接煙苗不僅成活率高，而且煙草接穗正常生長，能大幅降低煙葉煙堿含量，但嫁接技術技術性較強，對茄子和煙苗素質(zhì)要求較高，用工量相對較大，本試驗嫁接成活率為80%左右。隨著嫁接技術的優(yōu)化，嫁接效率和嫁接煙苗成活率會進一步提高。

4 結論

煙茄嫁接煙株植物學特征和農(nóng)藝性狀未顯著改變，煙葉煙堿含量降至極低水平，通過培土誘發(fā)不定根產(chǎn)生可以有效調(diào)控煙茄嫁接煙葉的煙堿含量。煙茄嫁接煙株葉綠素含量后期降低緩慢，成熟較慢，煙葉其他常規(guī)化學成分有所改變，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)、淀粉、總氮含量增加，總糖、還原糖含量降低。本研究為通過農(nóng)業(yè)措施選擇性大幅降低煙葉煙堿含量提供了技術支持。