• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    色譜法分析重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性應(yīng)用進展

    2018-03-17 06:21:52任華景劉曉志王志明
    實用藥物與臨床 2018年4期
    關(guān)鍵詞:重鏈變體殘基

    任華景,劉曉志,杜 力,高 健,王志明

    0 引言

    單克隆抗體由2條重鏈2條輕鏈組成,相對分子質(zhì)量高達150 kDa左右,結(jié)構(gòu)復(fù)雜。目前,單克隆抗體大多是采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)進行生產(chǎn),單克隆抗體在生物化學(xué)和生物物理方面是異質(zhì)的,這主要取決于復(fù)雜的翻譯后修飾和降解事件[1],導(dǎo)致了產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖基化修飾等不均一性及其相應(yīng)的變體產(chǎn)生[2]。采用一些電荷分離技術(shù)如等電聚焦(IEF)凝膠電泳、毛細管等電聚焦(cIEF)凝膠電泳、陽離子交換色譜(CEX)、陰離子交換色譜(AEX)分析單抗會發(fā)現(xiàn)變體,這些變體被稱為酸性或堿性物質(zhì)。IEF方法分析單抗,低于等電點(PI)的為酸性變體,高于PI的為堿性變體?;谏V法分析,酸性和堿性物質(zhì)界定是通過主峰的保留時間。CEX方法檢測酸性物質(zhì)變體峰比主要物質(zhì)峰先洗脫出來,堿性變體峰比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來;AEX方法檢測酸性物質(zhì)變體峰比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來,堿性變體峰比主要物質(zhì)峰早洗脫出來。

    盡管有學(xué)者同意采用等點聚焦電泳和層析圖譜方法來計算酸性和堿性物質(zhì)的量,但由于分離機制的不同,計算這些物質(zhì)的量仍存在區(qū)別。IEF分離抗體變體是基于總電荷的不同(表觀PI),但是,除總電荷外,在通過色譜法分離抗體變量時發(fā)現(xiàn)電荷分布也起著關(guān)鍵作用,這可能影響抗體和介質(zhì)的相互作用。IEF和離子交換(IEX)的不同已有報道[3]。如:鼠抗片段通過弱陽離子交換柱分離出峰的保留時間不同,但是采用IEF分析顯示了相同的PI[3]。人鼠嵌合體單抗的Fab片段無論是在輕鏈上還是在重鏈上都有焦谷氨酸,所以沒有發(fā)現(xiàn)不同的PI,可以通過強陽離子交換(SCX)來分析。這些例子說明基于色譜法分離不僅僅依賴于所有的電荷分布,在不存在電荷分布不同的情況下,一樣可以達到分離的效果。不過主要的分離動力還是來自于電荷分布的不同。

    在重組單克隆抗體的生產(chǎn)、儲存、運輸?shù)冗^程中,往往會發(fā)生產(chǎn)品的聚集、降解及各種翻譯后修飾,從而導(dǎo)致產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖基化修飾等不均一性及其相應(yīng)的變體產(chǎn)生[4]。電荷變體主要影響抗體體內(nèi)和體外性狀。已經(jīng)被證實抗體使用化學(xué)修飾能改變結(jié)合蛋白或細胞膜靶標,從而影響組織穿透、組織分布和藥代動力學(xué)(PK)[5]。變體的作用高度依賴于性質(zhì),翻譯后修飾的位置和程度,而最終這些變體形成了酸性和堿性物質(zhì)。

    本綜述主要基于色譜技術(shù)收集變體來分析描述酸性和堿性物質(zhì)[6],酸性和堿性物質(zhì)通常由IEF和cIEF觀察到,從IEF和cIEF收集足夠的材料用于詳細描述是具有挑戰(zhàn)性的。

    1 單克隆抗體的主要物質(zhì)

    抗體中的主要物質(zhì)在色譜中主峰的位置洗脫。主要物質(zhì)不一定對應(yīng)于未修飾或者未降解的抗體。主峰通常是由具有3種典型的翻譯后修飾的抗體種類組成:①N-末端谷氨酰胺(Gln)環(huán)化為pyroGlu;②去除重鏈C-末端賴氨酸(Lys);③帶有中性寡糖的CH2結(jié)構(gòu)域中保守的天冬酰胺(Asn)殘基的糖基化。主要物質(zhì)將作為對酸性和堿性物質(zhì)詳細表征的重要控制。

    1.1 N-末端Gln環(huán)化作用 N-末端Gln在輕鏈和重鏈之一或兩者的基因中編碼,其可以在合成后自發(fā)地環(huán)化形成pyroGlu。色譜法分析時發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗體含有N-末端pyroGlu而不是原始Gln,因此作為主峰洗脫[7-8]。

    1.2 C-末端賴氨酸去除 同樣,重鏈C-末端的Lys在重鏈基因中編碼。羧肽酶處理后導(dǎo)致的不完全去除的C-末端使得抗體攜帶0、1或2個C-末端賴氨酸殘基[9]。通常在主要物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)沒有任何C-末端賴氨酸的抗體[10]。

    1.3 N-連接的寡糖糖基化 在CH2結(jié)構(gòu)域中保守的Asn殘基用N-連接的寡糖糖基化,從哺乳動物細胞中獲得的重組單抗主要糖型是核心巖藻糖苷復(fù)合物雙天線結(jié)構(gòu),帶有0、1、2個末端半乳糖殘基。

    2 單克隆抗體的酸性物質(zhì)

    酸性物質(zhì)是抗體的變體,用CEX-HPLC法分析發(fā)現(xiàn)其比主峰早洗脫出來,用AEX法則比主峰晚洗脫出來。形成酸性物種的主要原因如下。

    2.1 唾液酸 唾液酸一般是構(gòu)成了酸性物質(zhì)。在NS0細胞中表達的重組IgG1抗體中的酸性級分中檢測到唾液酸[8]。在CHO細胞表達的重組IgG1抗體中的酸性級分中也檢測到了高水平的唾液酸[11]。唾液酸酶處理后,用CEX-HPLC分析山羊表達的重組單克隆抗體時,發(fā)現(xiàn)酸性物質(zhì)的百分比更低,表明唾液酸的存在是這些酸性物種的主要原因[10]。采用CEX分析時,在IgG4抗體的酸性區(qū)域中也檢測到了唾液酸[12]。

    2.2 天冬酰胺殘基的脫酰胺化 天冬酰胺殘基的脫酰胺化可能為酸性物質(zhì)產(chǎn)生的主要原因。脫氨發(fā)生在可變結(jié)構(gòu)域,特別是在暴露的和靈活的互補決定區(qū)(CDR)中以及在恒定結(jié)構(gòu)域中。CDR區(qū)殘基的脫酰胺化幾乎保證了酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。Asn殘基的脫酰胺在CH3的不變區(qū)域具有氨基酸序列SNGQPENNYK已被廣泛報道。盡管來自每個位點的特定產(chǎn)物仍然有爭議,但通常認為脫酰胺化僅發(fā)生在該序列的第1和第2個Asn殘基處[14]。恒定區(qū)中Asn殘基的脫酰胺化也最可能導(dǎo)致酸性物質(zhì)的形成[15]。

    2.3 其他修飾 其他修飾也可能導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生。如:通過CEX分析時,具有非經(jīng)典二硫鍵的IgG2(IgG2B和IgG2A /B)比具有經(jīng)典鍵聯(lián)(IgG2A)的分子早洗脫[16]。使用AEX分析時,首先,在重組人IgG2中鑒定的含有三硫鍵的抗體比主峰洗脫晚,因此認為對應(yīng)的是酸性物質(zhì)[17]。研究顯示,具有高甘露醇含量的抗體變體在重組單抗的酸性部分中富集,但是在高甘露糖寡糖和具有核心巖藻糖的復(fù)合雙觸角寡糖之間沒有電荷差異,這也證明了色譜法分離不僅基于電荷差異,而且還基于微妙的構(gòu)象差異[18]。已經(jīng)用于制劑以防止由曝光引起氧化的硫代硫酸鹽可以與抗體反應(yīng)以形成酸性物質(zhì)[19]。糖基化、還原糖和Lys殘基的側(cè)鏈或N-末端伯胺之間的反應(yīng)由于中和了正電荷,導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[20]。

    3 酸性物質(zhì)對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

    由于導(dǎo)致產(chǎn)生酸性物質(zhì)的各種修飾對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的潛在影響高度依賴于其位置。由于柔性鉸鏈區(qū),位于Fc區(qū)中的修飾可能對Fab片段沒有顯著影響。如:唾液酸的存在不影響抗體效力[7],但是對抗原結(jié)合和效力具有實質(zhì)性影響。CDR區(qū)中的脫氨基化導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力和重組單克隆抗體的效力降低[6]。糖基化增加聚集體的形成而不改變抗體構(gòu)象[21],表明由Lys的糖基化引起的表面正電荷降低可能導(dǎo)致抗體分子之間的較低排斥。另外,具有半胱氨?;磻?yīng)的抗體顯示出降低的熱穩(wěn)定性,更容易形成聚集體。

    4 單克隆抗體的堿性物質(zhì)

    堿性物質(zhì)在CEX-HPLC分析中比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來,而在AEX-HPLC分析中早于主要物質(zhì)峰洗脫出來的物質(zhì)。形成堿性物質(zhì)的一個主要原因歸納如下。

    4.1 C末端Lys不完全去除 形成堿性物質(zhì)的一個主要原因是不完全去除C末端Lys。具有重鏈C末端Lys的單抗,由于額外的正電荷,而比主要物質(zhì)更偏堿性[22]。由于羧肽酶B(CPB)能夠特異性地去除C-末端堿性氨基酸殘基,因此比較CPB消化前后抗體的色譜圖,可以清楚地證明C末端Lys對堿性物質(zhì)形成的貢獻。

    4.2 N末端Gln與輕鏈或重鏈或兩者的pyroGlu的不完全環(huán)化 堿性物質(zhì)形成的另一種常見的修飾是N末端Gln與輕鏈或重鏈或兩者pyroGlu的不完全環(huán)化。Gln最初編碼在基因中,但其可以經(jīng)歷自發(fā)反應(yīng)以產(chǎn)生pyroGlu。具有原始Gln抗體的表觀pI高于主要物質(zhì),因此被稱為堿性物質(zhì)[23]。

    4.3 脫酰胺化 與脫酰胺相似,異構(gòu)化頻繁發(fā)生在CDR區(qū)域,很少在恒定區(qū)域發(fā)生[24]。經(jīng)CEX分析后,重鏈CDR3中的帶有isoAsp 102的重鏈單克隆抗體比帶有原始Asp的抗體晚洗脫出來[25]。作為Asn脫酰胺和Asp異構(gòu)化的常見中間體的琥珀酰亞胺也可以有助于產(chǎn)生堿性物質(zhì)[18]。

    4.4 其他修飾 幾種其他修飾可以產(chǎn)生堿性物種。通過CEX-HPLC分析時,抗體Fc區(qū)中兩個保守的甲硫氨酸(Met)殘基的氧化在堿性區(qū)域得到洗脫[26]。在重組單抗的CDR2區(qū)域中的Met殘基的氧化還導(dǎo)致堿性物質(zhì)的產(chǎn)生[26]。去除重鏈C-末端Lys后脯氨酸殘基的酰胺化導(dǎo)致堿性物質(zhì)的形成[27]。在輕鏈或重鏈的Fc區(qū),具有從絲氨酸到精氨酸的單個氨基酸突變的重組單抗作為堿性物質(zhì)從CEX柱洗脫[28]。具有一個糖基化重鏈和一個具有短寡糖的重鏈的抗體也作為堿性物質(zhì)從CEX柱洗脫[29]。

    5 堿性物質(zhì)對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

    抗體的N-末端或C-末端的修飾對抗體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能具有實質(zhì)性影響,因為這些區(qū)域是高度暴露的,并且不是任何配體結(jié)合位點的一部分。研究已證明琥珀酰亞胺形成對抗原結(jié)合親和力和效力的影響,在重鏈CDR2中含有琥珀酰亞胺的Fab片段結(jié)合親和力降低,與具有原始Asn的抗體相比,具有琥珀酰亞胺的抗體顯示出的效力有所降低[26]。

    Fc區(qū)域中甲硫氨酸殘基的氧化不影響重組單抗的抗原結(jié)合與效力;然而,其確實引起主要在CH2結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化,導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低和聚集傾向增加[30]。熱穩(wěn)定性降低通過差示掃描量熱法(DSC)測量重鏈CDR2區(qū)域Met殘留的氧化得到證實[31]。

    6 結(jié)論

    制備出重組單抗樣品時,通常能觀察到酸性和堿性物質(zhì)。完全消除酸性和堿性物質(zhì)是不現(xiàn)實的和不必要的。對于與特異性宿主表達系統(tǒng)相關(guān)的重組單抗,一些蛋白修飾是特有的(如:通過山羊乳中的馬來酸修飾),還有一些蛋白修飾是在蛋白生產(chǎn)和配制過程中發(fā)生的(如:硫代硫酸鹽修飾)。其對生物功能的影響高度依賴于位點和修飾水平。對于局限于Fc區(qū)的修飾,即使存在較高水平也不會對結(jié)合親和力有直接影響。類似地,局限于Fab區(qū)的修飾可能不影響Fc相關(guān)功能,如:受體結(jié)合。修改的水平對于效果有很大的影響。如:Asn55的脫酰胺度較低在重鏈CDR區(qū)域不影響一種抗體的效力[7],但是一條重鏈中的isoAsp55或Asp55可將另一種抗體的效力降低[26]。脫酰胺對2種抗體影響的區(qū)別可能是由于與其相互作用的抗原不同,此外,脫酰胺占百分比也起了重要作用。通過色譜法分析已鑒定出導(dǎo)致酸性和堿性電荷變體的修飾,但解酸性和堿性變體的性質(zhì)仍不明確。因此,在單克隆抗體研發(fā)和制備的過程中,必須要評估酸性或堿性變體對主要物質(zhì)的穩(wěn)定性和功能的影響。修飾可能是關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)或關(guān)鍵過程屬性(KPA)。因此,為了確保治療性重組單克隆抗體的有效性和安全性,分析酸性和堿性物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要。

    參考文獻:

    [1] 于傳飛,王文波,劉春雨,等.離子交換色譜對抗 VEGFR2單抗的電荷異質(zhì)性分析[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2014,42(5):17-21.

    [2] Liu H,Gaza-Bulseco G,Faldu D,et al.Heterogeneity of monoclonal antibodies[J].J Pharm Sci,2008,97(7):2426-2447.

    [3] Moorhouse KG,Nashabeh W,Deveney J,et al.Validation of an HPLC method for the analysis of the charge heterogeneity of the recombinant monoclonal antibody IDEC-C2B8 after papain digestion[J].J Pharm Biomed Anal,1997,16(4):593-603.

    [4] 張坤明.人用重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性的研究進展[J].中國生物制品學(xué)雜志,2016,29(2):206-212.

    [5] Pardridge WM,Kang YS,Diagne A,et al.Cationized hyperimmune immunoglobulins:pharmacokinetics,toxicity evaluation and treatment of human immunodeficiency virus-infected human-peripheral blood lymphocytes-severe combined immune deficiency mice[J].J Pharmacol Exp Ther,1996,276(1):246-252.

    [6] Vlasak J,Ionescu R.Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods[J].Curr Pharm Biotechnol,2008,9(6):468-481.

    [7] Lyubarskaya Y,Houde D,Woodard J,et al.Analysis of recombinant monoclonal antibody isoforms by electrospray ionization mass spectrometry as a strategy for streamlining characterization of recombinant monoclonal antibody charge heterogeneity[J].Anal Biochem,2006,348(1):24-39.

    [8] Beck A,Bussat MC,Zorn N,et al.Characterization by liquid chromatography combined with mass spectrometry of monoclonal anti-IGF-1 receptor antibodies produced in CHO and NS0 cells[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005,819(2):203-218.

    [9] Harris RJ.Processing of C-terminal lysine and arginine residues of proteins isolated from mammalian cell culture[J].J Chromatogr A,1995,705(1):129-134.

    [10]Santora LC,Krull IS,Grant K.Characterization of recombinant human monoclonal tissue necrosis factor-alpha antibody using cation-exchange HPLC and capillary isoelectric focusing[J].Anal Biochem,1999,275(1):98-108.

    [11]Khawli LA,Goswami S,Hutchinson R,et al.Charge variants in IgG1:Isolation,characterization,in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats[J].MAbs,2010,2(6):613-624.

    [12]Alvarez M,Tremintin G,Wang J,et al.On-line characterization of monoclonal antibody variants by liquid chromatography-mass spectrometry operating in a two-dimensional format[J].Anal Biochem,2011,419(1):17-25.

    [13]Huang L,Lu J,Wroblewski VJ,et al.In vivo deamidation characterization of monoclonal antibody by LC/MS/MS[J].Anal Chem,2005,77(5):1432-1439.

    [14]Chelius D,Rehder DS,Bondarenko PV.Identification and characterization of deamidation sites in the conserved regions of human immunoglobulin gamma antibodies[J].Anal Chem,2005,77(18):6004-6011.

    [15]Gandhi S,Ren D,Xiao G,et al.Elucidation of degradants in acidic peak of cation exchange chromatography in an IgG1 monoclonal antibody formed on long-term storage in a liquid formulation[J].Pharm Res,2012,29(1):209-224.

    [16]Wypych J,Li M,Guo A,et al.Human IgG2 antibodies display disulfidemediated structural isoforms[J].J Biol Chem,2008,283:16194-16205.

    [17]Pristatsky P,Cohen SL,Krantz D,et al.Evidence for trisulfide bonds in a recombinant variant of a human IgG2 monoclonal antibody[J].Anal Chem,2009,81(15):6148-6155.

    [18]Yan B,Steen S,Hambly D,et al.Succinimide formation at Asn 55 in the complementarity determining region of a recombinant monoclonal antibody IgG1 heavy chain[J].J Pharm Sci,2009,98(10):3509-3521.

    [19]Lam XM,Yang JY,Cleland JL.Antioxidants for prevention of methionine oxidation in recombinant monoclonal antibody HER2[J].J Pharm Sci,1997,86(11):1250-1255.

    [20]Quan C,Alcala E,Petkovska I,et al.A study in glycation of a therapeutic recombinant humanized monoclonal antibody:where it is,how it got there,and how it affects charge-based behavior[J].Anal Biochem,2008,373(2):179-191.

    [21]Banks DD,Hambly DM,Scavezze JL,et al.The effect of sucrose hydrolysis on the stability of protein therapeutics during accelerated formulation studies[J].J Pharm Sci,2009,98(12):4501-4510.

    [22]Lau H,Pace D,Yan B,et al.Investigation of degradation processes in IgG1 monoclonal antibodies by limited proteolysis coupled with weak cation-exchange HPLC[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(11-12):868-876.

    [23]Ouellette D,Alessandri L,Chin A,et al.Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1 molecule[J].Anal Biochem,2010,397(1):37-47.

    [24]Terashima I,Koga A,Nagai H.Identification of deamidation and isomerization sites on pharmaceutical recombinant antibody using H(2)(18)O[J].Anal Biochem,2007,368(1):49-60.

    [25]Harris RJ,Kabakoff B,Macchi FD,et al.Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl,2001,752(2):233-245.

    [26]Chumsae C,Gaza-Bulseco G,Sun J,et al.Comparison of methionine oxidation in thermal stability and chemically stressed samples of a fully human monoclonal antibody[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,850(1-2):285-294.

    [27]Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,et al.Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain[J].Anal Biochem,2007,360(1):75-83.

    [28]Ren D,Zhang J,Pritchett R,et al.Detection and identification of a serine to arginine sequence variant in a therapeutic monoclonal antibody[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(27):2877-2884.

    [29]Gaza-Bulseco G,Bulseco A,Chumsae C,et al.Characterization of the glycosylation state of a recombinant monoclonal antibody using weak cation exchange chromatography and mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008,862(1-2):155-160.

    [30]Liu D,Ren D,Huang H,et al.Structure and stability changes of human IgG1 Fc as a consequence of methionine oxidation[J].Biochemistry,2008,47(18):5088-5100.

    [31]Teshima G,Li MX,Danishmand R,et al.Separation of oxidized variants of a monoclonal antibody by anion-exchange[J].J Chromatogr A,2011,1218(15):2091-2097.

    猜你喜歡
    重鏈變體殘基
    基于各向異性網(wǎng)絡(luò)模型研究δ阿片受體的動力學(xué)與關(guān)鍵殘基*
    基于DDPG算法的變體飛行器自主變形決策
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構(gòu)體中的應(yīng)用
    A型肉毒素重鏈干預(yù)神經(jīng)細胞組蛋白3乙?;降某醪窖芯?/a>
    一種新型的利用DSS交聯(lián)劑避免重鏈輕鏈干擾的免疫沉淀技術(shù)
    非仿射參數(shù)依賴LPV模型的變體飛行器H∞控制
    心肌血管緊張素Ⅱ在運動和高血壓性心肌肥大時肌球蛋白重鏈變化中的作用探討
    蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)序列與殘基種類間關(guān)聯(lián)的分析
    耀變體噴流高能電子譜的形成機制
    基于支持向量機的蛋白質(zhì)相互作用界面熱點殘基預(yù)測
    av福利片在线| 校园春色视频在线观看| av天堂久久9| 黑人操中国人逼视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲黑人精品在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| a级毛片在线看网站| 99久久精品国产亚洲精品| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品国产色婷婷电影| av网站在线播放免费| 国产亚洲欧美精品永久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 三级毛片av免费| 大码成人一级视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 女人精品久久久久毛片| av片东京热男人的天堂| 69精品国产乱码久久久| bbb黄色大片| 高清毛片免费观看视频网站 | 麻豆乱淫一区二区| 好男人电影高清在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 老司机福利观看| netflix在线观看网站| 美女视频免费永久观看网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精华一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜福利,免费看| 欧美在线一区亚洲| 欧美另类亚洲清纯唯美| 又黄又爽又免费观看的视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 另类亚洲欧美激情| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美日本中文国产一区发布| 啦啦啦 在线观看视频| 两个人免费观看高清视频| 无遮挡黄片免费观看| 飞空精品影院首页| 亚洲精品美女久久av网站| 一级片免费观看大全| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲色图综合在线观看| 丝袜在线中文字幕| 99热只有精品国产| 欧美日韩成人在线一区二区| 两个人看的免费小视频| 黄色成人免费大全| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲人成电影观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 老汉色∧v一级毛片| 久久天堂一区二区三区四区| 成年人黄色毛片网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲色图综合在线观看| 超碰成人久久| 麻豆成人av在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 视频在线观看一区二区三区| 露出奶头的视频| 午夜两性在线视频| e午夜精品久久久久久久| 亚洲av日韩在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 老鸭窝网址在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一级片'在线观看视频| 午夜成年电影在线免费观看| 在线观看免费高清a一片| 亚洲av片天天在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 久久狼人影院| 久久香蕉国产精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 香蕉久久夜色| 国产精品1区2区在线观看. | 日本wwww免费看| 看片在线看免费视频| 成人av一区二区三区在线看| 91成年电影在线观看| 女警被强在线播放| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品永久免费网站| 欧美日韩黄片免| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品无人区乱码1区二区| 中文字幕高清在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 岛国在线观看网站| 丝袜在线中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产亚洲一区二区精品| 成人av一区二区三区在线看| 免费高清在线观看日韩| 成人三级做爰电影| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品免费一区二区三区在线 | 丁香六月欧美| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产精品久久电影中文字幕 | 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 99精品久久久久人妻精品| 老司机午夜十八禁免费视频| svipshipincom国产片| 精品国内亚洲2022精品成人 | 9热在线视频观看99| 亚洲欧美一区二区三区久久| 美女福利国产在线| 一区二区三区激情视频| www.999成人在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 不卡av一区二区三区| 国产不卡一卡二| a级毛片在线看网站| 最新美女视频免费是黄的| 久久久精品区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 成人影院久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久中文字幕一级| 男女高潮啪啪啪动态图| 男人舔女人的私密视频| 国产成人精品无人区| 国产亚洲欧美98| videosex国产| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩欧美在线二视频 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| svipshipincom国产片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 动漫黄色视频在线观看| 精品人妻在线不人妻| 精品福利永久在线观看| 99热网站在线观看| netflix在线观看网站| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品人人爽人人爽视色| 黄色片一级片一级黄色片| 免费在线观看日本一区| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久九九热精品免费| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲专区国产一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲成人国产一区在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 窝窝影院91人妻| 老熟女久久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 看免费av毛片| videos熟女内射| 丝袜美腿诱惑在线| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品永久免费网站| 欧美性长视频在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 岛国毛片在线播放| 欧美在线一区亚洲| 一区在线观看完整版| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| x7x7x7水蜜桃| 一级黄色大片毛片| 久久久久精品人妻al黑| 99久久综合精品五月天人人| 久久久久久免费高清国产稀缺| 五月开心婷婷网| 国产成人欧美在线观看 | 欧美乱妇无乱码| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲五月色婷婷综合| 波多野结衣av一区二区av| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人免费观看视频高清| 操美女的视频在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利影视在线免费观看| 18禁国产床啪视频网站| 1024视频免费在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成在线人永久免费视频| 99热国产这里只有精品6| 午夜91福利影院| 精品人妻1区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产高清videossex| 在线观看免费视频日本深夜| 在线免费观看的www视频| 国产成人影院久久av| 正在播放国产对白刺激| 亚洲三区欧美一区| 日本黄色日本黄色录像| 91国产中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 大码成人一级视频| 看免费av毛片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 中文欧美无线码| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 啦啦啦免费观看视频1| 制服诱惑二区| 免费日韩欧美在线观看| 捣出白浆h1v1| 成人18禁在线播放| 免费看a级黄色片| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国精品久久久久久国模美| 一区二区三区激情视频| 精品一品国产午夜福利视频| 香蕉丝袜av| 夫妻午夜视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 黄色片一级片一级黄色片| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久久久国产电影| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜福利乱码中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 女警被强在线播放| 久热爱精品视频在线9| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品 欧美亚洲| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩成人在线一区二区| 水蜜桃什么品种好| 国产男女超爽视频在线观看| 国产高清videossex| www.自偷自拍.com| 国产成人影院久久av| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 极品人妻少妇av视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产野战对白在线观看| 一夜夜www| 免费观看精品视频网站| 久久精品国产a三级三级三级| 91精品三级在线观看| 国产av又大| 精品欧美一区二区三区在线| 少妇 在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲免费av在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产免费现黄频在线看| av片东京热男人的天堂| 精品福利观看| 91av网站免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美 日韩 精品 国产| 国产av精品麻豆| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲成人免费电影在线观看| 91精品三级在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 大型黄色视频在线免费观看| 大香蕉久久成人网| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美激情 高清一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 两性夫妻黄色片| 又黄又爽又免费观看的视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 捣出白浆h1v1| 精品久久久久久久久久免费视频 | 久久久久精品人妻al黑| 黑人欧美特级aaaaaa片| 在线永久观看黄色视频| 国产激情久久老熟女| av天堂在线播放| 久9热在线精品视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品九九99| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 一级片免费观看大全| 久久热在线av| 国产亚洲av高清不卡| 在线观看免费视频网站a站| 99riav亚洲国产免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| www日本在线高清视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 人妻久久中文字幕网| 麻豆乱淫一区二区| 五月开心婷婷网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 高清视频免费观看一区二区| 最新美女视频免费是黄的| tube8黄色片| 高清毛片免费观看视频网站 | 日本一区二区免费在线视频| netflix在线观看网站| 亚洲精品在线美女| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 人人妻人人澡人人看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品国产乱码久久久久久男人| 在线国产一区二区在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 看免费av毛片| 啦啦啦 在线观看视频| 精品第一国产精品| 1024香蕉在线观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品一二三| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 午夜福利视频在线观看免费| 两性夫妻黄色片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久国产一区二区| 国产精品1区2区在线观看. | а√天堂www在线а√下载 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲国产精品合色在线| 久久香蕉国产精品| av国产精品久久久久影院| 亚洲视频免费观看视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 丰满的人妻完整版| 正在播放国产对白刺激| 宅男免费午夜| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品一区二区免费欧美| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产一区在线观看成人免费| 中文欧美无线码| 91精品国产国语对白视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产区一区二久久| 黄色成人免费大全| 99riav亚洲国产免费| 国产视频一区二区在线看| 国产精品久久视频播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品成人免费网站| 日本黄色视频三级网站网址 | 老汉色∧v一级毛片| 成人手机av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜福利,免费看| 99久久精品国产亚洲精品| 不卡一级毛片| 亚洲黑人精品在线| 在线国产一区二区在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲视频免费观看视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 亚洲avbb在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品欧美一区二区三区在线| 在线观看66精品国产| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲成人国产一区在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 99国产综合亚洲精品| 脱女人内裤的视频| 精品国产国语对白av| 午夜福利免费观看在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品av久久久久免费| 久久 成人 亚洲| 久久精品国产清高在天天线| 极品人妻少妇av视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产男女超爽视频在线观看| 夫妻午夜视频| 久久精品国产a三级三级三级| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲 国产 在线| 制服诱惑二区| 国产精品影院久久| 首页视频小说图片口味搜索| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品一二三| 久久香蕉激情| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品免费大片| 午夜免费成人在线视频| 久9热在线精品视频| 飞空精品影院首页| 国产成人av教育| 国产99白浆流出| 亚洲人成77777在线视频| 多毛熟女@视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| www.熟女人妻精品国产| 国产男靠女视频免费网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产xxxxx性猛交| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲久久久国产精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产一区二区激情短视频| netflix在线观看网站| 免费观看人在逋| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品免费一区二区三区在线 | 日韩免费高清中文字幕av| 99在线人妻在线中文字幕 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 看免费av毛片| 嫩草影视91久久| 视频在线观看一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清 | 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美午夜高清在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线观看www视频免费| 美女高潮到喷水免费观看| 很黄的视频免费| 国产免费男女视频| 国产成人精品在线电影| 在线国产一区二区在线| 久久久国产精品麻豆| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 最新的欧美精品一区二区| 看片在线看免费视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 飞空精品影院首页| 女人被狂操c到高潮| 精品一品国产午夜福利视频| 久久青草综合色| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91老司机精品| 亚洲成人国产一区在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线视频色国产色| 免费av中文字幕在线| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲国产欧美网| 一级片免费观看大全| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲在线自拍视频| 在线观看一区二区三区激情| www.熟女人妻精品国产| 天堂动漫精品| 老司机深夜福利视频在线观看| 麻豆av在线久日| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 色老头精品视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久国产精品大桥未久av| 色综合婷婷激情| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品国产亚洲在线| 午夜老司机福利片| 精品一品国产午夜福利视频| 丁香六月欧美| 露出奶头的视频| 99国产精品99久久久久| 国产欧美亚洲国产| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩欧美一区视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 男女免费视频国产| 久久久精品区二区三区| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲成国产人片在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 视频在线观看一区二区三区| www.自偷自拍.com| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 免费黄频网站在线观看国产| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲第一av免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品福利观看| 一级,二级,三级黄色视频| 美女国产高潮福利片在线看| 极品教师在线免费播放| 中文字幕av电影在线播放| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 一区福利在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 两个人免费观看高清视频| 久久人妻av系列| 99国产综合亚洲精品| 一区二区三区激情视频| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 看黄色毛片网站| 亚洲黑人精品在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 中出人妻视频一区二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产av又大| 亚洲第一av免费看| 免费观看精品视频网站| 在线看a的网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 人妻久久中文字幕网| av有码第一页| av免费在线观看网站| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜福利乱码中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品欧美一区二区三区在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人妻 亚洲 视频| 一级毛片精品| 亚洲精品自拍成人| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产激情久久老熟女| 啦啦啦 在线观看视频| 激情在线观看视频在线高清 | 波多野结衣av一区二区av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品免费一区二区三区在线 | 在线播放国产精品三级| 91精品三级在线观看| 99国产精品99久久久久| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 在线看a的网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产黄色免费在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一级作爱视频免费观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产又色又爽无遮挡免费看| 91精品国产国语对白视频| 老鸭窝网址在线观看| 精品亚洲成国产av| 精品少妇久久久久久888优播| cao死你这个sao货| 国产精品影院久久| 久久热在线av| 交换朋友夫妻互换小说| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 午夜福利在线免费观看网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的|