光動(dòng)力診斷原理及最新研究進(jìn)展

顧 丹，劉 偉，2，林昭春，2△

GU Dan，LIU Wei，LIN Zhao-chun

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610031)

光動(dòng)力診斷(photodynamic diagnosis PDD)是指特定波長(zhǎng)的光照射一定的光敏物質(zhì)后產(chǎn)生的一系列化學(xué)、物理、生物等反應(yīng)用于診斷疾病的一種方法[1]。光敏藥物可在增生活躍的部位高濃度積聚。應(yīng)用特定波長(zhǎng)的光照射增生活躍的組織，組織即產(chǎn)生熒光，可以用于腫瘤、代謝活躍組織的診斷、定位[2]。利用這種熒光標(biāo)記異常組織的檢查方法，可發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法無(wú)法檢出的病變組織，從而確定了病變部位切除的范圍。

1 PDD原理

PDD又稱(chēng)為熒光診斷，利用的是光動(dòng)力反應(yīng)過(guò)程中相對(duì)簡(jiǎn)單的物理過(guò)程[3]，其基本原理是生物組織中的內(nèi)源性或外源性光敏物質(zhì)受到相應(yīng)波長(zhǎng)(可見(jiàn)光、近紅外線或紫外光)的光照射時(shí)，吸收光子能量，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的光敏物質(zhì)很不穩(wěn)定，迅速經(jīng)過(guò)物理退激或化學(xué)退激過(guò)程釋放出能量而返回基態(tài)，物理退激與化學(xué)退激是同時(shí)存在而又相互競(jìng)爭(zhēng)的兩個(gè)反應(yīng)過(guò)程，其物理退激過(guò)程中可以產(chǎn)生熒光，通過(guò)分析熒光光譜能進(jìn)行疾病的診斷[4]。目前熒光動(dòng)力學(xué)主要通過(guò)自體熒光進(jìn)行診斷以及利用外源性光敏物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生熒光來(lái)進(jìn)行光動(dòng)力診斷兩種方法[5]。人體組織的大部分是由蛋白質(zhì)、核酸和類(lèi)脂化合物組成的，它們含有發(fā)熒光和不發(fā)熒光的色素，在不加外來(lái)光敏劑的條件下，生物組織的最大特征反映就是生物組織受激勵(lì)而產(chǎn)生的熒光，即被稱(chēng)之為自發(fā)熒光。腫瘤組織和正常組織的自發(fā)熒光光譜有很大區(qū)別。因此，臨床上基于激光感生熒光光譜學(xué)技術(shù)利用腫瘤的特征熒光峰作為診斷惡性腫瘤的方法。此外，由于增生旺盛組織中積聚產(chǎn)生的原卟啉Ⅸ(PpⅨ)在紫外照射下能發(fā)出特有的磚紅色熒光[6]，利用這一特性，可使得癌變組織可視化，這不僅具有光動(dòng)力診斷潛力，而且特異性較高的5-氨基酮戊酸(ALA)/PpIX熒光成像可輔助病變定界、識(shí)別殘留病灶、提高照光成功率和減少?gòu)?fù)發(fā)[7]。

2 PDD的光敏劑

PDD中最重要的是光敏劑，光敏劑在代謝活躍組織中具有較高的選擇性，光敏劑能夠在增生的組織內(nèi)高度積聚，而在正常組織中光敏劑的濃度較低，增生組織積聚的光敏劑被特定波長(zhǎng)的光所激發(fā)，光敏劑吸收光子能量從基態(tài)躍遷到某一激發(fā)態(tài)，處于某一激發(fā)態(tài)的分子可以通過(guò)不同馳豫過(guò)程失去一部分能量回到基態(tài)，其中一種為輻射馳豫，發(fā)出熒光或磷光。光敏劑被特定波長(zhǎng)的光激發(fā)能產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光，熒光肉眼可見(jiàn)，并可被圖像增強(qiáng)器放大和被光譜儀器記錄，故可用來(lái)作定位、診斷之用[2]。

國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的應(yīng)用于皮膚領(lǐng)域的光敏劑藥物包括四環(huán)素、金絲桃素、血卟啉衍生物(HpD)、ALA及其酯類(lèi)衍生物氨基酮戊酸己酯(HAL)等。ALA及其HAL本身不產(chǎn)生熒光，僅是細(xì)胞內(nèi)血紅素生物合成的起始物資，在細(xì)胞線粒體呼吸鏈中，甘氨酸由琥珀酸單酰輔酶A催化合成ALA，ALA在胞漿中經(jīng)由卟膽原、尿卟啉原III、糞卟啉原III，再回到線粒體中由原卟啉原Ⅸ合成PpIX，在亞鐵螯合酶的作用下合成血紅素。血紅素的聚集又負(fù)反饋抑制ALA合成。在此通路中，只有PpIX是具有熒光特性的物質(zhì)，在正常情況下細(xì)胞中的PpIX是中間產(chǎn)物，通常不會(huì)聚集。當(dāng)外源性ALA增加時(shí)，PpIX在增值旺盛細(xì)胞聚集具備產(chǎn)生熒光的條件。ALA誘導(dǎo)內(nèi)生的PpIX可以選擇性的吸收波長(zhǎng)為375～440 nm的光躍遷為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的PpIX分子釋放熱能和新光子，新光子能量較低，形成波長(zhǎng)為635～700 nm的紅色熒光，利用激光熒光光敏技術(shù)可以看到發(fā)射紅色熒光的增生組織[8，9]。

3 PDD的激發(fā)光

PDD中另一重要元素是光源。隨著激光技術(shù)的發(fā)展及光纖技術(shù)的逐步完善，激光誘導(dǎo)熒光診斷技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到迅速的發(fā)展[10]。目前激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)在診斷惡性腫瘤方面的應(yīng)用價(jià)值，已日漸引起國(guó)內(nèi)外腫瘤專(zhuān)家的關(guān)注。激發(fā)光功率的大小直接影響到所誘導(dǎo)出的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度的變化是一個(gè)十分重要的特性參數(shù)。激發(fā)功率越大，所誘導(dǎo)出的熒光強(qiáng)度越大，因而便于檢測(cè)，但激發(fā)功率過(guò)大，就會(huì)造成正常組織的損傷。因此臨床上使用多大功率的激發(fā)光來(lái)激發(fā)組織體，是組織光學(xué)劑量中的一個(gè)重要研究課題[11]。光源的選擇主要考慮兩個(gè)因素：①要與光敏劑的吸收光譜相匹配；②要有一定的輸出功率，并能有效地傳輸?shù)讲≡畈课籟12]；③光斑的光強(qiáng)分布均勻。根據(jù)治療部位的特殊需要可選擇相干光源，即激光(波長(zhǎng)單一，激發(fā)光敏劑的效率和組織的穿透深度均較非相干光源優(yōu)越)或非相干光源，如發(fā)光二極管(LED)等。由于LED技術(shù)的發(fā)展，其價(jià)格遠(yuǎn)低于激光，近年有用于體表光動(dòng)力治療的國(guó)產(chǎn)LED光源進(jìn)入臨床。激光可與光導(dǎo)纖維耦合傳輸，通過(guò)選用不同的光纖輸出端頭(如微透鏡、彌散、球狀、柱狀光纖)行表面、腔道和組織間照光。光導(dǎo)纖維還可以通過(guò)內(nèi)腔鏡將光導(dǎo)入空腔臟器。臨床上光動(dòng)力療法應(yīng)用了不同波長(zhǎng)的激光光源。另外，高功率KTP 激光與染料調(diào)制系統(tǒng)的組合也可產(chǎn)生高輸出功率的長(zhǎng)波長(zhǎng)單色光，也是一種理想的PDD光源。長(zhǎng)脈沖泵浦染料激光(LP-PDL)也可用于PDD 治療。目前，各種波長(zhǎng)的半導(dǎo)體激光器已逐步成為國(guó)內(nèi)外激光醫(yī)療設(shè)備的主流。此外，在國(guó)家863計(jì)劃支持下，我國(guó)自主創(chuàng)新的全固態(tài)激光光動(dòng)力治療鮮紅斑痣系統(tǒng)也已應(yīng)用于臨床，其各項(xiàng)性能指標(biāo)均為國(guó)際領(lǐng)先[13]。

4 PDD在臨床中的應(yīng)用

4.15-氨基-3-乙酰丙酸在腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療對(duì)于延長(zhǎng)生命和治療癌癥來(lái)說(shuō)非常重要。近年來(lái)，PDD的出現(xiàn)為腫瘤的早期診斷提供了新的思路和新方法。腫瘤組織和正常組織的自發(fā)熒光光譜有很大區(qū)別。因此，臨床上基于激光感生熒光光譜學(xué)技術(shù)利用腫瘤的特征熒光峰作為診斷惡性腫瘤的方法。隨后，為了提高該方法的診斷定位能力，利用腫瘤組織能特異吸收光敏劑的特點(diǎn)，采用與光敏劑匹配的相應(yīng)波長(zhǎng)激光誘導(dǎo)熒光進(jìn)行醫(yī)療診斷，于是產(chǎn)生了又一種腫瘤診斷手段即PDD[14]?；痉椒ㄊ窍认蚧颊咦⑸涔饷魟┤鏗PD后，用低功率密度氪離子、氬離子或其他黃綠光照射患處及其周?chē)?，發(fā)出紅色熒光為陽(yáng)性區(qū)。自1955年Rassmuss-en-taxdall首次研究報(bào)道熒PDD之后，PDD在眾多腫瘤中相繼得以應(yīng)用。目前已用于皮膚口腔黏膜、鼻咽、子宮頸和陰道等部位惡性腫瘤的診斷。并可通過(guò)內(nèi)窺鏡讓光導(dǎo)纖維傳導(dǎo)激光進(jìn)入內(nèi)腔對(duì)氣管癌、胃癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等腔內(nèi)腫瘤做出定位診斷。在熒光不太強(qiáng)，內(nèi)窺鏡下難以辯認(rèn)時(shí)，還可用圖象增強(qiáng)器和多光導(dǎo)分析儀(OMA)提高其分辯能力。也可利用時(shí)間分辨熒光光譜技術(shù)提高其熒光診斷的靈敏度和選擇性[15]。近來(lái)邢岐榮等又提出飛秒激光激活光敏劑雙光子熒光法診斷癌癥的新概念。邢岐榮等認(rèn)為處于基態(tài)的熒光物質(zhì)，同時(shí)吸收兩個(gè)低能相干激發(fā)光子后，躍遷到激發(fā)態(tài)，再弛豫返回基態(tài)過(guò)程中發(fā)出熒光稱(chēng)作雙光子熒光。由于雙光子熒光過(guò)程是一個(gè)非線性相干作用過(guò)程，與單光子激發(fā)熒光相比，雙光子熒光診斷癌癥應(yīng)具有更高的分辨率和診斷深度。固體飛秒激光器的單脈沖能量很小，且峰值功率很高，很適合作為產(chǎn)生雙光子熒光的激發(fā)光源。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，均可觀察到飛秒激光激發(fā)HpD的雙光子熒光譜，而對(duì)照組的正常組織部位未觀察到明顯的雙光子熒光發(fā)射。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飛秒激光激發(fā)外源性熒光素產(chǎn)雙光子熒光的方法是一種極具應(yīng)用前景的癌癥診斷新技術(shù)[16]。

4.25-氨基-3-乙酰丙酸在尖銳濕疣診斷中的應(yīng)用隨著HPV感染率的逐年增高，HPV相關(guān)性疾病尖銳濕疵、鮑恩樣丘疹病的發(fā)病率也逐漸增多。HPV引起的亞臨床和潛伏感染是導(dǎo)致尖銳濕優(yōu)、鮑恩樣丘疹病復(fù)發(fā)和難以治愈的主要原因之一。自90年代ALA光動(dòng)力治療腫瘤以來(lái)，國(guó)外學(xué)者也將ALA誘導(dǎo)的PpIX熒光診斷技術(shù)應(yīng)用于腫瘤診斷。尖銳濕疣是一種HPV感染引起的增生性疾病，以6、11、16、18、31、33型感染為多見(jiàn)，該病毒有高度的宿主和組織特異性，能引起人體皮膚和黏膜的鱗狀上皮增殖。被HPV感染后的細(xì)胞增生活躍，能夠特異性的濃集光敏劑。王秀麗等[17]專(zhuān)家利用光動(dòng)力治療尖銳濕疣，利用光動(dòng)力磚紅色熒光與醋酸白染色對(duì)比潛伏期/亞臨床的尖銳濕疣。結(jié)果顯示：在醋酸白實(shí)驗(yàn)陰性者中有14例尖銳濕疣和3例鮑恩樣丘疹病皮損周?chē)?.5 cm熒光陽(yáng)性，4例尖銳濕疣和1例鮑恩樣丘疹病皮損周?chē)? cm部位呈現(xiàn)熒光并檢測(cè)出與皮損相同型別的HPVDNA，表明ALA-PDD對(duì)尖銳濕疣的潛伏感染有一定的診斷意義。也證實(shí)以往關(guān)于尖銳濕疣患者皮損周?chē)? cm以?xún)?nèi)“正常皮膚”往往會(huì)有HPV感染的報(bào)道。同時(shí)也表明皮損周?chē)? cm部位依然可能存在HPV潛伏感染。李慶娟等[18]研究表明尖銳濕疣皮膚或粘膜破損周?chē)? cm以?xún)?nèi)的皮膚有尖銳濕疣感染，甚至連陰毛內(nèi)都可查見(jiàn)尖銳濕疣，消除亞臨床感染能有效的降低復(fù)發(fā)率，病變部位也很容易留下疤痕和產(chǎn)生尿道狹窄等不良反應(yīng)。李海燕等[19]研究顯示：局部外用ALA后，在尖銳濕疣亞臨床感染和潛伏感染區(qū)域也可見(jiàn)到原卟啉IV形成的熒光。

4.3PDD在痤瘡中的應(yīng)用痤瘡是一種常見(jiàn)的毛囊皮脂腺慢性炎癥性皮膚病，主要發(fā)生于青春期和成人，發(fā)病率達(dá)到80%～95%。痤瘡主要靠藥物治療，且病程長(zhǎng)、治愈率低、易反復(fù)等特點(diǎn)。需要一種新的有效并且低不良反應(yīng)的局部治療方法。PDD可有效的顯示出痤瘡丙酸桿菌在皮膚中的潛伏病灶。研究發(fā)現(xiàn)ALA可被毛囊皮脂腺和異常角質(zhì)形成細(xì)胞吸收，并轉(zhuǎn)化為PpIX[20]。利用激光熒光光譜技術(shù)可顯示出磚紅色熒光，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

5 PDD在皮膚中的未來(lái)與展望

光敏劑是光動(dòng)力診斷和治療的核心物質(zhì)。光動(dòng)力診斷和治療的提出、發(fā)展及應(yīng)用都是隨著光敏劑的發(fā)展而逐漸完善的。新型光敏劑的開(kāi)發(fā)研究對(duì)整個(gè)光動(dòng)力療法的發(fā)展具有舉足輕重的作用。雖然各種各樣的光敏劑廣泛應(yīng)用于臨床，但還有很多問(wèn)題亟待進(jìn)一步深入研究[21]。如：①光敏劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)是影響其光生物活性和光動(dòng)力性質(zhì)的重要因素，需深入研究光敏劑化學(xué)結(jié)構(gòu)；②合成各種修飾基團(tuán)，特別是控制修飾基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及光學(xué)活性，以改善光敏劑的靶向性、滲透性、吸收性及代謝方面的特性來(lái)達(dá)到高效低毒的目的；③新型卟啉類(lèi)光敏劑的合成方法及制備、分離純化等過(guò)程有待工業(yè)化；④如果光敏劑和單克隆抗體或蛋白連接，光敏劑就可以很容易在腫瘤細(xì)胞上找到落腳點(diǎn)，有利于光敏劑在腫瘤組織中的選擇性富集[23]。

PDD中，光源為低功率密度氪離子、氬離子或其他黃綠光照射患處及其周?chē)l(fā)出紅色熒光為陽(yáng)性區(qū)。因此，尋找具有分辨率強(qiáng)、滲透性好、選擇性高的光源是PDD的首要任務(wù)。

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