流式細(xì)胞術(shù)及PCR技術(shù)在兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病監(jiān)測(cè)中的價(jià)值*

唐 雪 ，憲 瑩 ，溫賢浩 ，郭玉霞 ，管賢敏 ，王世一 ，肖劍文 △（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤中心；2.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨檢中心，重慶400014）

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是兒童白血病最常見(jiàn)的亞型，其中 B 細(xì)胞性 ALL（B?ALL）占 70%～75%，兒童B?ALL最常見(jiàn)的白血病基因有ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL相關(guān)基因等[1]，不同基因型預(yù)后有所不同。微小殘留?。∕RD）是白血病治療后體內(nèi)殘留白血病細(xì)胞的狀態(tài)，是白血病獨(dú)立的預(yù)后因素[2]。目前主要的 MRD 檢測(cè)方法有 2種[2?3]：流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)殘留白血病細(xì)胞表面抗原，即FCM?MRD；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)檢測(cè)初診時(shí)存在的白血病基因表達(dá)，即PCR?MRD。本研究針對(duì)初診時(shí) ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL基因陽(yáng)性B?ALL患兒采用FCM及PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)MRD，分析2種方法的靈敏度及特異性是否存在差異，并分析MRD與B?ALL預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為2012年9月至2015年1月重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院收治并接受CCLG?ALL?2008方案[4]（簡(jiǎn)稱08方案）化療初診為B?ALL的患兒。本研究得到重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬均簽訂知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷年齡小于18歲；（2）初診時(shí)按WHO?2008淋巴及造血組織腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)[5]完善骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫分型、染色體核型分析及融合基因檢查；（3）ETV6/RUNX1、E2A/PBX1 或 MLL基因陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院前接受過(guò)抗白血病治療；（2）成熟B?ALL及混合細(xì)胞白血??；（3）繼發(fā)性ALL或合并其他腫瘤；（4）初診時(shí)合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病和（或）睪丸白血??；（5）確診前死亡，或確診后放棄治療，或非疾病因素未完成1個(gè)療程化療。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 按照08方案，所有患兒在不同時(shí)間點(diǎn)（TP），即TP1（誘導(dǎo)緩解療程第15天）、TP2（誘導(dǎo)緩解第33天）、TP3（鞏固治療第1天）時(shí)采集骨髓進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1.1 骨髓細(xì)胞學(xué) TP1、TP2及TP3均進(jìn)行骨髓細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。骨髓液涂片5～8張并分類計(jì)數(shù)至少200個(gè)有核細(xì)胞，幼稚細(xì)胞比例小于5%為M1型，幼稚細(xì)胞比例5%～25%為M2型，幼稚細(xì)胞比例大于25%為M3型。

1.2.1.2 FCM?MRD 在TP2及TP3采用FCM技術(shù)檢測(cè)MRD。采集EDTA抗凝骨髓液2 mL并分離單個(gè)核細(xì)胞（MNC），每管加入1×106個(gè)細(xì)胞，根據(jù)初治時(shí)免疫表型選擇個(gè)體化檢測(cè)抗體組合，每種單抗20μL，混勻后室溫避光15 min，加入1倍溶血素裂解紅細(xì)胞，離心，棄上清。PBS洗滌1次，加入500μL PBS使用四色流式細(xì)胞儀檢測(cè)。出現(xiàn)下述情況則定義為MRD陽(yáng)性[2]：正常表達(dá)抗原強(qiáng)度改變（增強(qiáng)或減弱）和（或）丟失、異常表達(dá)其他系別標(biāo)志、早期和晚期抗原同時(shí)表達(dá)、幼稚細(xì)胞比例明顯增多且均質(zhì)性表達(dá)等。以這些殘存細(xì)胞占骨髓MNC 總數(shù)的比例作為 MRD 的數(shù)值，F(xiàn)CM?MRD＜10?4為陰性。

1.2.1.3 PCR?MRD 在TP2、TP3時(shí)采用PCR技術(shù)檢測(cè)MRD。EDTA抗凝骨髓液分離MNC并提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。初診MLL陽(yáng)性者經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR）技術(shù)擴(kuò)增后聚丙烯酰胺凝膠電泳及染色分析，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶為 PCR?MRD陽(yáng)性[6]。初診ETV6/RUNX1或E2A/PBX1陽(yáng)性者實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測(cè)標(biāo)本基因拷貝數(shù)，用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)標(biāo)本中ABL濃度作為對(duì)照，得出待測(cè)標(biāo)本基因拷貝數(shù)、基因拷貝數(shù)與ABL濃度比值，基因拷貝數(shù)小于10-5為 PCR?MRD 陰性[7?8]。

1.2.2 治療方案及危險(xiǎn)度分組 患兒按照08方案進(jìn)行危險(xiǎn)度分組[4]并接受治療。（1）標(biāo)危（SR）組必須同時(shí)滿足以下條件。①初診年齡1～＜10歲；②初診WBC≤50×109L-1；③無(wú)以下染色體改變和（或）基因檢出：t（9；22）或BCR/ABL基因、11q23相關(guān)異常或MLL基因重排、t（1；19）或 E2A/PBX1 基因；④潑尼松試驗(yàn)[4]敏感（PGR）；⑤TP1骨髓細(xì)胞學(xué)結(jié)果為非M3型、TP2時(shí)骨髓細(xì)胞學(xué)結(jié)果完全緩解且 FCM?MRD＜10-4。（2）高危（HR）組滿足以下條件之一。①t（9；22）或BCR/ABL基因陽(yáng)性；②11q23相關(guān)異?；騇LL基因重排陽(yáng)性；③潑尼松試驗(yàn)不敏感（PPR）；④初診IR患兒TP1骨髓細(xì)胞學(xué)為M3 型；⑤FCM?MRD：TP2時(shí) FCM?MRD≥10-2或 TP3時(shí)FCM?MRD≥10-4。（3）中危（IR）組：既不符合 SR 又不符合HR標(biāo)準(zhǔn)的患兒。

1.2.3 療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 患兒隨訪至2017年2月，療效以完全緩解（CR）率、無(wú)事件生存率（EFS）描述。CR 定義為化療后無(wú)明顯白血病癥狀體征、血常規(guī)大致正常且骨髓細(xì)胞學(xué)為M1[9]。EFS定義為自診斷之日起到第1次事件或末次隨訪日期，事件包括治療失?。ㄔ缙谒劳龌蛭催_(dá)CR）、骨髓和（或）髓外復(fù)發(fā)、CR期內(nèi)死亡、發(fā)生第二腫瘤及放棄治療等[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以中位數(shù)、±s表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)分析，標(biāo)準(zhǔn)值小于1采用Fisher確切概率法分析；采用Kaplan?Meier生存分析法計(jì)算生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 共61例患兒納入本研究，包括ETV6/RUNX1陽(yáng)性組（A組）34例，E2A/PBX1陽(yáng)性組（B組）15例及MLL陽(yáng)性組（C組）12例。A組因診斷時(shí)，WBC≥50×109L-1且PPR列入HR組1例，診斷年齡大于或等于10歲列入IR組1例，F(xiàn)CM?MRD異常列入IR組3例；B組因PPR及FCM?MRD異常列入HR組各1例?；蛐头纸M與危險(xiǎn)度分組情況見(jiàn)表1。

表1 患兒危險(xiǎn)度分布情況（n）

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)FCM及PCR檢測(cè)MRD結(jié)果 A組TP2時(shí)FCM?MRD陽(yáng)性5例，其中PCR?MRD陰性3例。B組TP2時(shí) PCR?MRD陽(yáng)性4例，僅1例 FCM?MRD陽(yáng)性。C組TP2時(shí)4例FCM?MRD陽(yáng)性，PCR?MRD陽(yáng)性僅1例。表明治療早期FCM?MRD與PCR?MRD并不完全相符。A組TP3時(shí)FCM?MRD均轉(zhuǎn)陰但仍有1例PCR?MRD陽(yáng)性。B組TP2后復(fù)發(fā)放棄1例，完成TP3評(píng)估14例，F(xiàn)CM?MRD均轉(zhuǎn)陰但仍有3例PCR?MRD陽(yáng)性。C組TP2后放棄治療或失訪5例，完成TP3評(píng)價(jià)7例，F(xiàn)CM?MRD及PCR?MRD均轉(zhuǎn)陰。雖樣本量太少無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但仍提示PCR?MRD治療后期可能靈敏度高于FCM?MRD。見(jiàn)表 2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)FCM及PCR檢測(cè)MRD結(jié)果（n）

TP2、TP3時(shí)三組患兒共做FCM及PCR監(jiān)測(cè)116例次，F(xiàn)CM?MRD陽(yáng)性 10例次（陽(yáng)性率為 8.62%），PCR?MRD陽(yáng)性17例次（陽(yáng)性率為14.66%），PCR?MRD陽(yáng)性率高于 FCM?MRD，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TP2時(shí)FCM?MRD陽(yáng)性率及PCR?MRD檢查陽(yáng)性率分別為16.39%和 27.88%，PCR?MRD陽(yáng)性率也高于 FCM?MRD，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 療效評(píng)估 61例患兒總CR率為98.36%（60/61），三組 CR率（A、B、C組分別為 100.00%、100.00% 和91.67%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A 組均CR，睪丸及中樞復(fù)發(fā)各 1例，3年EFS為（93.1±4.7）%。B組均CR，TP2時(shí)FCM?MRD陰性而PCR?MRD陽(yáng)性4例均骨髓復(fù)發(fā)，F(xiàn)CM?MRD及PCR?MRD均陰性11例中感染死亡2例，其余9例生存，3年EFS為（60.0±12.6）%。C組1例未CR，11例CR患兒放棄治療4例，其余7例（FCM?MRD及PCR?MRD均陰性）中感染及異基因造血干細(xì)胞移植死亡各1例，3年EFS為（62.9±17.9）%。隨訪至2017年2月，所有患兒3年總EFS為（80.0±5.4）%，A 組 EFS均高于 B、C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 1。B 組 PCR?MRD 陽(yáng)性患兒全部復(fù)發(fā)，而PCR?MRD陰性患兒無(wú)復(fù)發(fā)，見(jiàn)圖2。

圖1 三組患兒EFS比較

圖2 B組患兒EFS比較

3 討 論

白血病是兒童時(shí)期發(fā)病率最高的惡性腫瘤，B?ALL最為常見(jiàn)[1]。隨著診治技術(shù)的改進(jìn)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，兒童B?ALL療效不斷提高，治療達(dá)到CR后患兒體內(nèi)仍剩余的微量殘留白血病細(xì)胞是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的重要因素[2]，因此，尋找可靠的指標(biāo)用于檢測(cè)MRD對(duì)于指導(dǎo)白血病治療非常重要。

初診時(shí)，白血病細(xì)胞具有與正常血細(xì)胞表達(dá)水平、表達(dá)時(shí)機(jī)或組合不同的抗原表達(dá)，即白血病相關(guān)免疫表型（LAIP）[10]，治療達(dá)到CR后殘留白血病細(xì)胞一般仍保留其初診時(shí)LAIP。因此，可利用FCM確定初診時(shí)LAIP，定期隨訪其水平變化可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MRD。FCM?MRD 簡(jiǎn)便快速，但該方法存在若干缺陷[11]：（1）目前尚未發(fā)現(xiàn)真正意義上的白血病特異性抗原，LAIP只是基于正常白細(xì)胞表面分化抗原的多參數(shù)分析，治療后可能抗原漂移導(dǎo)致假陰性；（2）不同實(shí)驗(yàn)室及人員個(gè)體化差異大，導(dǎo)致不同中心檢測(cè)的穩(wěn)定性較差；（3）FCM需使用新鮮標(biāo)本，故對(duì)檢測(cè)結(jié)果有疑問(wèn)時(shí)試驗(yàn)難以重復(fù)。

ETV6/RUNX1、E2A/PBX1及MLL相關(guān)基因是兒童B?ALL最常見(jiàn)的白血病基因，分別占兒童B?ALL的20%～35%、5%～10% 和 5%[12]。融合基因是白血病特異性的分子遺傳學(xué)標(biāo)記且是獨(dú)立的預(yù)后因素。因此，初診時(shí)利用PCR技術(shù)檢測(cè)患者存在的融合基因、定期隨訪該基因表達(dá)情況也可以監(jiān)測(cè)MRD[13]，且可以克服FCM技術(shù)存在的缺點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，治療早期PCR?MRD陽(yáng)性率雖高于 FCM?MRD，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明治療早期根據(jù)醫(yī)院自身?xiàng)l件選擇其中一種檢測(cè)方法均可有效監(jiān)測(cè)MRD并指導(dǎo)治療。但MLL陽(yáng)性患兒復(fù)發(fā)率高和治療后LIAP容易發(fā)生抗原漂移并導(dǎo)致FCM?MRD誤差，故長(zhǎng)期隨訪時(shí)PCR?MRD效果可能會(huì)優(yōu)于FCM?MRD。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2A/PBX1陽(yáng)性B?ALL患兒治療后FCM?MRD早期轉(zhuǎn)陰而PCR?MRD陽(yáng)性者全部復(fù)發(fā)，提示該基因陽(yáng)性患兒治療后選擇PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)MRD可能優(yōu)于FCM。但PCR技術(shù)僅能針對(duì)初診時(shí)有特異性白血病基因患兒進(jìn)行，對(duì)于基因檢測(cè)陰性患兒仍只能采用FCM檢測(cè)MRD。

總之，使用FCM或PCR技術(shù)均可以有效檢測(cè)兒童B?ALL的MRD水平，并指導(dǎo)其分層治療。但FCM存在的缺陷均可以被PCR技術(shù)彌補(bǔ)，而PCR檢測(cè)為白血病特有標(biāo)記，因此，對(duì)于有特異性白血病基因的患兒，采用PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)MRD尤其是長(zhǎng)期隨訪時(shí)可能優(yōu)于FCM。

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