Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨形成和重建中的調(diào)節(jié)作用*

楊 冰 周 慧 樊飛躍 孫元明

骨重建是一個(gè)持續(xù)不斷的骨組織吸收以及骨形成的過(guò)程。骨形成由源自間質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞完成[1]，而骨吸收則由來(lái)自多能造血干細(xì)胞的破骨細(xì)胞完成[2]。破骨細(xì)胞一般在3～5周內(nèi)完成重建單元中的骨吸收，而成骨細(xì)胞則要用3～5個(gè)月的時(shí)間對(duì)基質(zhì)進(jìn)行礦化以完成骨的重建。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）[3]以及Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化有著調(diào)節(jié)作用。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與BMPs、Wnt相互作用對(duì)成骨細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用。在破骨細(xì)胞中，Notch通路通過(guò)核因子NF-κB受體激活因子配體（Receptor Activa?tor of NF-κB Ligand,RANKL）/核因子NF-κB受體激活因子（Receptor Activator of NF-κB,RANK）/骨保護(hù)素（Osteoprotey?erin,OPG）系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)骨形成、骨細(xì)胞的存活及骨重建起關(guān)鍵作用。

1 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在進(jìn)化中高度保守，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及生存方面起重要作用。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，Notch失活導(dǎo)致果蠅翅膀上產(chǎn)生缺口。在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有4種受體（Notch1、2、3、4）和5種配體（Jagged1、2，Delta 1、3、4）。這些配體和受體都是單跨膜蛋白，需要細(xì)胞之間的相互接觸才能激活。當(dāng)相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體結(jié)合后，Notch受體的胞外部分會(huì)被腫瘤壞死因子（TNF）-α轉(zhuǎn)化酶酶切，酶切后產(chǎn)生不穩(wěn)定的過(guò)度多肽，后者被γ-分泌酶復(fù)合體識(shí)別并進(jìn)一步將Notch受體的胞內(nèi)部分酶切，產(chǎn)生具有活性的Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch intra?cellular domain,NICD）。γ-分泌酶復(fù)合體是由Presenilin（PS）蛋白酶1、2以及調(diào)節(jié)組件Presenilin Enhancer 2（PEN2）、An?terior pharynx defective 1（Aph1）和Nicastrin（NCT）組成的[6]。在沒(méi)有NICD存在的情況下，CSL（在人為CBF1，在鼠為RBPJ在果蠅為Suppressor of hairless，在線蟲為L(zhǎng)ag1）和帶有組蛋白去乙酰復(fù)合物（histone deacetylase complexes，HDAC）的共同抑制蛋白一起與DNA相結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄。γ-分泌酶復(fù)合體酶切產(chǎn)物NICD可以進(jìn)入細(xì)胞核將共同抑制蛋白置換下來(lái)，并與CSL及Mastermind-Like（MAML）蛋白形成三元復(fù)合體，將CSL蛋白由原來(lái)的轉(zhuǎn)錄抑制作用轉(zhuǎn)換為激活作用[7]。在經(jīng)典的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，被轉(zhuǎn)錄的基因有Hairy Enhancer of Split（HES）1、HES5、HES6、HES7、HES-related with YRPF mo?tif（HEY）1、HEY2及HEYL。

2 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨發(fā)育及骨重建中的作用

2.1 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)軟骨內(nèi)骨形成的影響 在骨發(fā)育過(guò)程中，間質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞而形成透明軟骨，隨后透明軟骨內(nèi)的軟骨細(xì)胞變肥大、礦化并最終凋亡。在此過(guò)程中，血管進(jìn)入軟骨中，進(jìn)而使骨細(xì)胞前體繼續(xù)完成軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程。

Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)軟骨的形成有抑制作用。Grogan等[8]研究表明Notch通路下游產(chǎn)物HES1以及HEY1可以與DNA序列中臨近SOX9增強(qiáng)子識(shí)別位點(diǎn)的序列相結(jié)合，從而抑制軟骨細(xì)胞特異性膠原蛋白Ⅱα(Ⅰ)啟動(dòng)子的活性。Mead等[9]研究表明在小鼠體內(nèi)增強(qiáng)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性可對(duì)軟骨細(xì)胞的分化和礦化起抑制作用。Hilton等[10]研究發(fā)現(xiàn)條件性敲除PS1并且伴隨PS2失活導(dǎo)致Notch蛋白不能被酶切從而使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到阻礙后，肥厚軟骨細(xì)胞發(fā)生聚集可導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼畸形；同時(shí)敲除Notch1和Notch2的小鼠也表現(xiàn)出了同樣的表型，從而證明PS1和PS2失活而出現(xiàn)的表型也是由于Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺失造成的；僅條件性敲除Notch2后也出現(xiàn)了與同時(shí)敲除Notch1和Notch2后的表型，說(shuō)明Notch2蛋白在軟骨內(nèi)骨形成的調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用。

2.2 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化及功能的影響 在體外研究中，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞前體向成骨細(xì)胞分化既有激活也有抑制作用。小鼠的體內(nèi)研究有利于認(rèn)識(shí)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用。Engin等[11]研究表明NICD的表達(dá)置于在2.3 kb膠原Ⅰ型啟動(dòng)子控制之下的轉(zhuǎn)基因小鼠由于成骨細(xì)胞未成熟或功能紊亂導(dǎo)致骨量增加及生長(zhǎng)遲緩。而Zanotti等[12]研究則表明將NICD的表達(dá)置于在3.6 kb膠原Ⅰ型啟動(dòng)子控制之下的轉(zhuǎn)基因小鼠由于成骨細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致骨量的下降。這2種不同的表型是由于2.3 kb和3.6 kb膠原Ⅰ型啟動(dòng)子分別導(dǎo)致了成骨細(xì)胞停留在向成熟成骨細(xì)胞分化的不同階段。NICD的表達(dá)置于在2.3 kb膠原Ⅰ型啟動(dòng)子控制之下抑制了成骨細(xì)胞分化的終末階段致使形成了較多的未成熟或功能紊亂的成骨細(xì)胞[11]。而在3.6 kb膠原Ⅰ型啟動(dòng)子控制之下表達(dá)的NICD，則在成骨細(xì)胞分化早期發(fā)揮了抑制作用，從而導(dǎo)致成熟成骨細(xì)胞數(shù)量的下降[12]。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并不是通過(guò)影響成熟成骨細(xì)胞功能來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用的，而是通過(guò)調(diào)節(jié)其前體的分化來(lái)發(fā)揮作用。Hilton等[10]研究表明Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以使間質(zhì)干細(xì)胞前體保持于未分化的狀態(tài)，而不分化為成熟成骨細(xì)胞。

BMPs是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor,TGF）超家族的成員，其對(duì)成骨細(xì)胞的分化起重要作用[13]。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使Delta1和Jagged1在MC3T3-E1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并不能直接引起成骨細(xì)胞分化上的變化，而是增強(qiáng)了BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化作用[14]。

Wnt蛋白是36～46 ku富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，在成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)中起重要作用[15]。Deregowski等[16]研究表明NICD過(guò)表達(dá)抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制了成骨細(xì)胞的分化。

2.3 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)破骨細(xì)胞分化及功能的影響 破骨細(xì)胞是來(lái)源于單核-巨噬細(xì)胞系具有骨吸收作用的多核細(xì)胞。破骨細(xì)胞的分化和激活是由成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控的。RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macro?phage colony-stimulating factor,M-CSF）對(duì)破骨細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。RANKL是TNF家族的成員，其表達(dá)受一系列骨吸收因子包括1,25-二羥基維生素D3、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、甲狀旁腺激素相關(guān)多肽（parathyroid hormone-related peptide, PTHrP）以及TNF-α的調(diào)控。M-CSF可以誘導(dǎo)單核-巨噬破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和存活，而RANKL與其受體RANK相結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的分化與成熟。OPG是一種可溶性的偽受體，其可以與RANKL結(jié)合但并沒(méi)有促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的作用。RANKL與OPG都在骨基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞上表達(dá)，其比例對(duì)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性非常重要[17]。

Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)于破骨細(xì)胞前體的分化具有抑制作用[11,18]。Bai等[18]研究表明體外敲除骨基質(zhì)巨噬細(xì)胞中的Notch1、Notch2、Notch3可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖與分化；破骨細(xì)胞中的Notch1失活會(huì)抑制其OPG的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與骨吸收能力，從而證明Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)破骨細(xì)胞具有抑制作用。Fukushima等[19]研究表明在破骨細(xì)胞前體中誘導(dǎo)Notch2的表達(dá)可提高nuclear factor of activated T cell c1（NFATc1）啟動(dòng)子的活性，增強(qiáng)RANK誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成作用。這表明在特定條件下，Notch2可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成。在成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)作用方面：Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，從而減弱RANK通路介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化作用[20]。Bai等[18]研究表明破骨細(xì)胞上表達(dá)有Notch配體(Delta1，Jagged1和Jagged2),將成骨細(xì)胞上的Notch1敲除后，由于OPG表達(dá)的降低可引起破骨細(xì)胞數(shù)量的增加。

綜上所述，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)軟骨、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)失調(diào)可以導(dǎo)致骨發(fā)育失調(diào)、骨肉瘤等疾病[21]。對(duì)于Notch通路在整個(gè)成骨細(xì)胞成熟過(guò)程中起的調(diào)節(jié)作用以及其對(duì)維持骨組織穩(wěn)態(tài)中的作用目前還不是很清楚。在以后的研究中可以采用敲除或者激活Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子以及其他手段深入研究。

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