小曲中優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯酵母分離鑒定及其產(chǎn)酯條件優(yōu)化

王鵬昊，關(guān)統(tǒng)偉，張習(xí)超，趙順先，向慧平，張家旭，趙小林，歐夢(mèng)瑩，林宜錦，許琴

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039) 2(成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川 大邑，611330)

小曲也被稱作酒藥、酒餅、米曲，是小曲酒生產(chǎn)過(guò)程中的糖化發(fā)酵劑，在小曲酒釀造過(guò)程中同時(shí)起著糖化和發(fā)酵的雙重作用。乙酸乙酯是小曲酒中的主體香味成分，同時(shí)也是我國(guó)清香型白酒的主體香氣組成成分[1]。在清香型白酒的所有酯類物質(zhì)中，乙酸乙酯在酯類物質(zhì)中處于主導(dǎo)地位，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質(zhì)量及風(fēng)格。并且在小曲原酒中，乙酸乙酯含量高的酒香味好，提高乙酸乙酯含量有利于提高原酒質(zhì)量。而在小曲酒釀造過(guò)程中所產(chǎn)生的乙酸乙酯主要是由小曲中微生物代謝產(chǎn)物的生化反應(yīng)生成的，酵母在其中扮演了重要角色。酵母在白酒釀造發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生多種物質(zhì)，主要有酯類、醇類、酸類等，此外還會(huì)有少量的烷烴類、胺類、芳香烴類、酮類、醛類等物質(zhì)產(chǎn)生。這些物質(zhì)的含量各異，從而構(gòu)成了各酵母菌的不同發(fā)酵香氣。產(chǎn)香酵母在酒的發(fā)酵釀制過(guò)程中的主要作用是產(chǎn)酯(在小曲酒或清香型白酒中主要是乙酸乙酯)，對(duì)酒體具有增酯、提香的作用，故又稱其為生香酵母[2]。產(chǎn)香酵母可以利用有機(jī)酸、糖、醛以及鹽類物質(zhì)為原料，在酯酶的參與下合成眾多酯類物質(zhì)，以此來(lái)增香，去除酒中的雜味，從而使酒體協(xié)調(diào)，改善小曲酒的品質(zhì)[3-5]。目前，產(chǎn)酯酵母廣泛應(yīng)用于小曲酒生產(chǎn)中。我國(guó)作為白酒生產(chǎn)大國(guó)，具有優(yōu)質(zhì)的天然曲種資源，但國(guó)內(nèi)土著生香酵母曲工業(yè)化開(kāi)發(fā)的并不是很多，本實(shí)驗(yàn)旨在從釀酒小曲中分離得到優(yōu)良產(chǎn)酯酵母，并對(duì)其產(chǎn)酯條件進(jìn)行優(yōu)化研究，為我國(guó)土著產(chǎn)酯酵母在白酒工業(yè)化生產(chǎn)的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

釀酒小曲由成都蜀之源酒業(yè)有限公司、瀘州自然香實(shí)業(yè)有限公司和四川省瀘州市美酒源酒業(yè)有限公司提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母浸膏、H2SO4、HCl、NaCl等常規(guī)試劑均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；真菌DNA提取試劑盒、蛋白酶K、溶菌酶、膠回收試劑盒等購(gòu)自上海生工成都分公司。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

查氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO33g，7H2O·MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0～6.5。

孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，葡萄糖10 g， KH2PO41 g，瓊脂20 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， 1 g/L孟加拉紅溶液3.3 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.1.4 活化培養(yǎng)基

液體YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2 g， 酵母提取物1 g， 蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL。

1.1.5 產(chǎn)酯培養(yǎng)基

葡萄糖8 g，酵母提取物1 g，蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL。

1.2 主要儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋DHP-902，上海中安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱LDX-75KB，北京市六一儀器廠；真空干燥箱 SWJ-2F，上海一恒科技有限公司；恒溫水浴鍋 TB-214，金壇市醫(yī)療儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；雙定時(shí)電泳儀MLS-1，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，旋渦震蕩儀DY-8C，蘇州凈化設(shè)備有限公司；數(shù)顯式酸度計(jì)AR-323，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平HH-S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HSS 86.50 型全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器，意大利 DANI公司;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010 plus，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的初篩

取1 g樣品小曲粉加入到裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，充分振蕩搖勻，此時(shí)的稀釋倍數(shù)為10-1倍；然后用移液槍從試管中移取1 mL菌懸液并加入9 mL無(wú)菌生理鹽水，振蕩搖勻，此時(shí)稀釋倍數(shù)為10-2倍；逐級(jí)稀釋可制得10-3、10-4、10-5倍的樣品稀釋液。取100 μL 10-4和10-5倍的稀釋菌液均勻涂布于PDA、查氏培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，挑菌在PDA培養(yǎng)基純化。

1.3.2 產(chǎn)酯菌株篩選

用接種環(huán)將純化后得到的菌株接種一環(huán)到液體活化培養(yǎng)基中，經(jīng)28 ℃活化培養(yǎng)24 h，隨后取液體培養(yǎng)基10 mL接種到100 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。然后向發(fā)酵液再加入20 mL無(wú)水乙醇以及40 mL蒸餾水后進(jìn)行蒸餾(可加入幾滴植物油做消泡劑)，收集100 mL蒸餾液，再對(duì)蒸餾液進(jìn)行總酯與乙酸乙酯的測(cè)定。

1.3.3 總酯的測(cè)定

總酯測(cè)定方法為皂化回流法[6-8]。

1.3.4 蒸餾液的GC-MS分析條件。

蒸餾液中的乙酸乙酯含量分析采用GCMS-QP2010 plus進(jìn)行分析。分析條件為：色譜柱為Rtx-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)；程序升溫為35 ℃保持2 min，以10 ℃/min至 250 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，無(wú)分流進(jìn)樣。載氣，高純He(99.99%)；載氣流速 1.0 mL/min。電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為40～600。

1.3.5 高產(chǎn)酯菌株的分子鑒定與形態(tài)及生理生化觀察

優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯菌株經(jīng)溶菌酶破壁后使用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。以ITS4和ITS5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL； dNTP4 μL；引物ITS4 1 μL；引物ITS5 1 μL；DNA模板1 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；ddH2O 37.5 μL。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；修復(fù)延伸72 ℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化產(chǎn)物送往上海生工成都分公司測(cè)序，將測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索，使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9-10]。

初步生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[11]對(duì)產(chǎn)酯菌株進(jìn)行測(cè)試，主要包括糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、類淀粉物質(zhì)生成實(shí)驗(yàn)、尿素水解實(shí)驗(yàn)等。

1.3.6 產(chǎn)酯條件的研究

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)酯量的影響

將優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯菌株按不同條件分別接種于產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)，以產(chǎn)酯量和乙酸乙酯生成量為考察指標(biāo)，研究溫度、pH、酒精添加量以及發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)情況的影響[12]，以確定各單因素最佳條件范圍。用0.1 mol/L鹽酸來(lái)調(diào)節(jié)pH值，用無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)酒精含量，實(shí)驗(yàn)方法參照1.3.2，對(duì)餾液進(jìn)行總酯和乙酸乙酯的測(cè)定。

1.3.6.2 正交實(shí)驗(yàn)

以4因素4水平做正交實(shí)驗(yàn)[13-14]，以此探究溫度、pH、酒精添加量以及發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響，產(chǎn)酯條件水平表如表1所示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用spss19.0軟件Duncan方差齊性檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯酵母的篩選

從樣品小曲中經(jīng)分離培養(yǎng)基初步分離純化得到了7株疑似酵母菌的菌株，再將篩選得到的這7株菌株采用產(chǎn)酯培養(yǎng)基復(fù)篩，其產(chǎn)酯情況結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明，在初篩的7株酵母菌中，產(chǎn)酯情況差異較大，總酯含量最高的為菌株Y5，總酯達(dá)2.684 g/L，乙酸乙酯含量為2.481 g/L，占總酯量的92.4%，顯著高于其他菌株?？傰ズ孔畹偷臑閅3菌株，總酯0.014 g/L，其乙酸乙酯含量并未檢出。為此本實(shí)驗(yàn)選用Y5菌株作為產(chǎn)酯優(yōu)質(zhì)菌株以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

表2 篩選菌株產(chǎn)酯情況Table 2 Screening strains of producing strains

注：“-”表示乙酸乙酯含量極低或未檢出其含量。

2.2 Y5菌株的鑒定

2.2.1 Y5菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)

觀察Y5的菌落形態(tài)：如圖1所示，Y5菌株的菌落呈白色，菌落直徑1～2 mm，圓形凸起、表面光滑，邊緣整齊，大小均勻，有水果香；液態(tài)培養(yǎng)時(shí)表面有菌膜，液體澄清。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，進(jìn)一步得出其生理生化試驗(yàn)結(jié)果：如表3所示，Y5菌株可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、D-甘露醇和檸檬酸，不能利用乳糖、D-木糖和L-鼠李糖，可利用硝酸鹽作為氮源，不能產(chǎn)生類淀粉物質(zhì)，可分解利用尿素。

圖1 Y5菌株劃線平板圖Fig.1 Y5 strain crossed plate chart

生理生化試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果葡萄糖+乳糖-蔗糖+D?木糖-L?鼠李糖-海藻糖+麥芽糖+D?甘露醇+檸檬酸+硝酸鹽利用+類淀粉物質(zhì)生成-尿素水解試驗(yàn)+

注：“+”代表能夠利用；“-”代表不能利用。

2.2.2 菌株Y5的分子鑒定

在生理生化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)Y5酵母的DNA產(chǎn)物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，所擴(kuò)增得到的片段的電泳條帶亮度大，無(wú)拖尾，通過(guò)與D2000 Maker的對(duì)比，可以知道擴(kuò)增得到的分子大小在600 bp左右，與預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度一致。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工成都分公司進(jìn)行測(cè)序，再將其序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行Blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明Y5菌株與公布的WickerhamomycesanomalusCBS250(登錄號(hào)： KY105862)同源性達(dá)到99.7%，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示。結(jié)合Y5生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Y5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可確定Y5為異常威克漢姆酵母。

圖3 菌株Y5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Strain Y5 phylogenetic tree

2.3 Y5產(chǎn)酯條件單因素試驗(yàn)

2.3.1 溫度對(duì)產(chǎn)酯量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)總酯產(chǎn)量與乙酸乙酯產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4，總酯含量與乙酸乙酯含量隨著溫度的升高，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。溫度的高低直接影響酵母菌體內(nèi)的酯化酶活性，進(jìn)而影響酵母菌產(chǎn)酯能力，且溫度的升高會(huì)加速酯的水解及揮發(fā)。綜和總酯含量和乙酸乙酯的生成量，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)二者含量達(dá)到最高(總酯產(chǎn)量為3.197 g/L，乙酸乙酯含量為2.941 g/L)，酯化酶的活性達(dá)到最大，因此選擇發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖4 溫度對(duì)產(chǎn)酯量的影響Fig.4 Effect of temperature on the amount of ester produced

2.3.2 pH對(duì)產(chǎn)酯量的影響

如圖5所示，培養(yǎng)基的pH對(duì)酵母菌酯的生成量影響較大，隨著pH的增加，總酯產(chǎn)量和乙酸乙酯生成量顯著提高，但是pH過(guò)大會(huì)使得二者含量下降。綜合看來(lái)培養(yǎng)基的pH值在pH 4～6的范圍內(nèi)總酯和乙酸乙酯的生成量較高，當(dāng)pH值偏高或偏低時(shí)，其生成乙酸乙酯的能力會(huì)有所下降，從而導(dǎo)致總酯的含量較低。其中，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為pH 5時(shí)，總酯和乙酸乙酯的生成量達(dá)到峰值，總酯含量達(dá)到3.629 g/L，乙酸乙酯生成量為3.198 g/L。

圖5 pH對(duì)產(chǎn)酯量的影響Fig.5 Effect of pH on the amount of ester produced

2.3.3 酒精含量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

從圖6可知，酵母菌Y5對(duì)乙醇有較好的適應(yīng)性，在培養(yǎng)基中加入一定的乙醇對(duì)菌株產(chǎn)酯有一定的促進(jìn)作用，但是過(guò)量的乙醇對(duì)酵母的產(chǎn)酯性能有一定的抑制作用。隨著乙醇添加量的增加，總酯產(chǎn)量和乙酸乙酯產(chǎn)量都呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，乙醇添加量為2%時(shí)產(chǎn)酯量達(dá)到最高，當(dāng)乙醇添加量超過(guò)2%時(shí)，酯含量反而下降，不利于乙酸乙酯的生成。因此選擇乙醇添加量為2%，此條件下總酯含量達(dá)到3.579 g/L，乙酸乙酯生成量為3.185 g/L。

圖6 酒精含量對(duì)產(chǎn)酯量的影響Fig.6 Effect of alcohol content on the amount of ester produced

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯量的影響

由發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯量的影響(圖7)可知，菌株Y5在不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酯量有差異，并且發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響較大，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，酵母的生長(zhǎng)急劇上升，此時(shí)酵母的產(chǎn)酯代謝較為旺盛，其總酯含量和乙酸乙酯產(chǎn)量在第4天時(shí)達(dá)到峰值，產(chǎn)量分別為3.687 g/L和3.204 g/L。而后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在第5～6天下降趨勢(shì)明顯，可能原因是隨著時(shí)間延長(zhǎng)酵母代謝產(chǎn)生的酯類物質(zhì)揮發(fā)。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the amount of ester produced

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取適當(dāng)?shù)囊蛩胤秶O(shè)計(jì)正交表，考察Y5菌株的最適產(chǎn)酯條件，產(chǎn)酯條件結(jié)果與極差分析見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 產(chǎn)酯條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Production of orthogonal experiment results

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 5 Analysis of orthogonal experimental variance

注：方差分析表的置信區(qū)間為95.0%，“*”代表顯著。

如表4所示，根據(jù)極差分析，在A(溫度)、B(pH值)、C(酒精含量)、D(發(fā)酵時(shí)間)4個(gè)影響因素中pH值對(duì)產(chǎn)酯量影響最大，其影響的順序?yàn)閜H值>發(fā)酵時(shí)間>酒精含量>溫度。使用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，如表5所示，pH值與發(fā)酵時(shí)間這兩個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響顯著(Sig<0.05)。并且通過(guò)試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合為A3B2C3D2，即在溫度30 ℃、pH 4、乙醇體積分?jǐn)?shù)4%、發(fā)酵時(shí)間3d時(shí)菌株產(chǎn)酯量達(dá)到最大，通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得Y5菌株在該條件下總酯產(chǎn)量為4.065 g/L，乙酸乙酯產(chǎn)量3.677 g/L；相比優(yōu)化之前，其總酯含量顯著提高51.5%，乙酸乙酯含量顯著提高48.2%。

3 結(jié)論

從工業(yè)化釀酒小曲中分離篩選得到1株優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯酵母菌株Y5，經(jīng)產(chǎn)酯培養(yǎng)基初篩其總酯達(dá)2.684 g/L，乙酸乙酯含量為2.481 g/L，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和分子鑒定，確定Y5菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。目前應(yīng)用于白酒中的產(chǎn)酯酵母多屬于漢遜酵母、產(chǎn)朊酵母屬、假絲酵母屬和球擬酵母屬等[17]，本實(shí)驗(yàn)的分離鑒定豐富了白酒中產(chǎn)酯酵母的菌種資源，為該種酵母在白酒生產(chǎn)利用提供了理論基礎(chǔ)。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)將菌株Y5的產(chǎn)酯條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)極差分析，在A(溫度)、B(pH值)、C(酒精含量)、D(發(fā)酵時(shí)間)4個(gè)影響因素的順序?yàn)閜H值>發(fā)酵時(shí)間>酒精含量>溫度，方差分析結(jié)果表明pH值與發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響顯著，試驗(yàn)得出的最優(yōu)產(chǎn)酯條件為：在初始pH 4、乙醇體積分?jǐn)?shù)4%的培養(yǎng)基中30 ℃恒溫發(fā)酵3 d。在該條件下Y5菌株總酯產(chǎn)量為4.065 g/L，乙酸乙酯產(chǎn)量3.677 g/L；相比優(yōu)化之前，其總酯含量顯著提高51.5%，乙酸乙酯含量顯著提高48.2%。根據(jù)嚴(yán)錦等[1]報(bào)道，從清香型小曲中分離出一株異常漢遜式酵母，其產(chǎn)乙酸乙酯和總酯能力分別為2.152 g/L和2.368 g/L；陳維新等[12]以腐爛菠蘿為原料，篩選出一株馬克斯克魯維酵母，其乙酸乙酯的最高產(chǎn)量達(dá)3.13 g/L。綜合看來(lái)，本實(shí)驗(yàn)篩選出的Y5菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力，可作為白酒釀造生產(chǎn)中重要的產(chǎn)酯菌種資源，為國(guó)內(nèi)土著生香酵母曲工業(yè)化開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景。關(guān)于該菌株在小曲酒或相關(guān)白酒中的具體應(yīng)用還需作進(jìn)一步研究。

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