微衛(wèi)星狀態(tài)與術(shù)后大腸癌患者的臨床及病理特征相關(guān)性研究*

陳美麗 李琳 禹立霞 劉寶瑞 錢曉萍 楊覓

目前，大腸癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第3位［1］，盡管其在中國人群中的發(fā)生率要低于西方國家，但近年來卻在迅速增長［2］。在大腸癌中，存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）。PCR方法為最早確立的檢測(cè)MSI狀態(tài)的分子手段［3］，且被認(rèn)為是臨床上檢測(cè)MSI的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250等5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)檢測(cè)，比較腫瘤患者的樣本組織和正常組織的位點(diǎn)突變狀態(tài)判斷微衛(wèi)星狀態(tài)，如果樣本有2個(gè)及2個(gè)以上位點(diǎn)存在MSI狀態(tài)則判斷為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（high-frequency MSI，MSI-H），如果有1個(gè)位點(diǎn)存在MSI狀態(tài)則判斷該患者為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（low-frequency MSI，MSI-L），無位點(diǎn)存在MSI則判斷為微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)（microsatellite stability，MSS）。

MSI狀態(tài)被認(rèn)為與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)［4］，且具有較為特殊的臨床病理特征。有文獻(xiàn)報(bào)道，中國發(fā)生在近端結(jié)腸和直腸的大腸癌患者中，MSI與MSS的大腸癌患者相比確診分期更早，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更低［5］。為進(jìn)一步明確微衛(wèi)星狀態(tài)與大腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，本研究采用PCR-毛細(xì)血管電泳法檢測(cè)腸癌組織中微衛(wèi)星狀態(tài)，分析已確診的大腸癌患者的微衛(wèi)星狀態(tài)與其臨床資料、RAS突變情況及免疫組織化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)MGMT、Lgr5、EGFR、Ki-67等的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2014年6月至2017年6月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院行腸癌切除手術(shù)的572例大腸癌患者，其中男性348例、女性224例?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn)為：1）通過病理診斷確診的結(jié)腸或直腸癌；2）術(shù)前未接受過抗腫瘤治療；3）提供可用于分析的臨床及病理資料，包括性別、年齡、家族史、病變部位、病理分期、分化程度、淋巴結(jié)、神經(jīng)、脈管轉(zhuǎn)移等。原位癌（高級(jí)上皮內(nèi)瘤變）及大腸癌為第二原發(fā)性腫瘤的患者排除。入組患者以微衛(wèi)星狀態(tài)分為MSI-H組和MSS/MSI-L組。本研究由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PCR-毛細(xì)管電泳檢測(cè)微衛(wèi)星狀態(tài)及RAS突變情況 選取腸癌組織蠟塊進(jìn)行切片脫蠟（以相應(yīng)的正常組織為對(duì)照），顯微鏡下觀察蘇木素-伊紅染色（H&E）切片，刮取腫瘤細(xì)胞豐富區(qū)，用DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA，采用MSI檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增腸癌組織中BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250等5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)的突變狀態(tài)（圖1），當(dāng)癌組織存在2個(gè)及2個(gè)以上突變位點(diǎn)時(shí)判定為MSI-H，當(dāng)僅存在1個(gè)位點(diǎn)突變時(shí)判定為MSI-L，無位點(diǎn)存在突變則判定為MSS。同時(shí)擴(kuò)增KRAS基因第2、3、4外顯子，NRAS第2、3外顯子，產(chǎn)物直接純化，進(jìn)行DNA雙向測(cè)序分析。以正常黏膜組織DNA為陰性對(duì)照，測(cè)試結(jié)果與NCBI標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比，尋找突變位點(diǎn)。

圖1 腸癌組織和相應(yīng)的正常遠(yuǎn)癌切斷組織的PCR-毛細(xì)血管電泳法檢測(cè)NCI推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ki-67、EGFR、MGMT和Lgr5的表達(dá)情況 腸癌組織標(biāo)本在10%中性福爾馬林中固定24～48 h，常規(guī)脫水、固定、石蠟包埋、切片后用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67、EGFR、MGMT及Lgr5。每張切片中含有的正常腸黏膜、炎癥細(xì)胞等作為內(nèi)對(duì)照，根據(jù)文獻(xiàn)判讀［6］免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖2）。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野按染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再按陽性細(xì)胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。染色與陽性細(xì)胞百分比的評(píng)分乘積為最終分?jǐn)?shù)，0判定為陰性，1～3判定為1+或弱陽性，4～7判定為2+或中度陽性，8～12判定為3+或強(qiáng)陽性。

圖2 MGMT和EGFR在腸癌組織中的免疫組織化學(xué)表達(dá)情況（SP×100）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)各臨床病理參數(shù)及微衛(wèi)星表型之間的差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特征

在572例大腸癌患者中（表1），男性348例、女性224例，MSS或MSI-L大腸癌中男性發(fā)病比例高于女性，MSI-H大腸癌中女性發(fā)病比例高于男性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在發(fā)病年齡方面，本研究中確診大腸癌的年齡為15～91歲，中位年齡64歲。在MSS/MSIL組中確診大腸癌的年齡為15～91歲，中位年齡64歲；MSI-H組確診大腸癌的年齡為33～88歲，中位年齡55歲。MSS/MSI-L大腸癌＞55歲的病例明顯高于MSI-H患者，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)MSI-H大腸癌患者具有惡性腫瘤家族史的比例高于MSS/MSI-L患者（10.00%vs.5.64%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.436）。572例大腸癌病例中病變部位包括174例左半結(jié)腸、158例右半結(jié)腸、6例左半結(jié)腸和右半結(jié)腸同時(shí)存在病變、232例直腸及2例結(jié)腸和直腸同時(shí)存在病變的病例，MSI-H和MSS/MSI-L兩組大腸癌在發(fā)病部位的構(gòu)成比方面比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），與MSI-H組相比，MSS/MSI-L組患者好發(fā)于直腸（229/532vs.3/40，43.0%vs.7.5%），而MSI-H組更好發(fā)于結(jié)腸（37/40vs.301/532，92.5%vs.56.6%)，尤其是右半結(jié)腸（27/40vs.131/532，67.5%vs.24.6%）。

表1 大腸癌患者臨床特征在不同微衛(wèi)星狀態(tài)中的比較

2.2 患者的病理資料分析

572例大腸癌患者中，包含286例Ⅰ/Ⅱ期及286例Ⅲ/Ⅳ期病例（表2），其中MSI-H大腸癌確診時(shí)的TNM分期低于MSS/MSI-L大腸癌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但浸潤腸壁的深度兩組相似，未見顯著性差異。在MSI-H大腸癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例較MSS/MSIL低、形成癌結(jié)節(jié)的比例少，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MSI-H的大腸癌脈管、神經(jīng)受癌組織累及的比例較MSS/MSI-L低，而遠(yuǎn)處器官或組織受累的比例高，但均未見顯著性差異。在分化程度和Ki-67方面比較兩組未見顯著性差異，在MSI-H和MSS/MSI-L兩組大腸癌組織中，含黏液成分的分別占17.5%和8.5%，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大腸癌患者一般病理資料在不同微衛(wèi)星狀態(tài)中的比較

2.3 RAS突變及MGMT、Lgr5、EGFR免疫組織化學(xué)表達(dá)情況

本研究共檢測(cè)了572例患者KRAS第2外顯子的表達(dá)情況（表3），總突變率為44.1%，MSS/MSI-L組的KRAS第2密碼子的突變率較MSI-H組高（45.7%vs. 22.5%，P=0.004）。隨著近年來臨床對(duì)全RAS基因檢測(cè)的關(guān)注，本研究亦檢測(cè)了其中261例患者的KRAS第3、4外顯子的突變表達(dá)情況，總突變率分別為2.3%和4.6%，其中MSI-H病例的第3、4外顯子突變率分別為5.0%、10.0%，MSI-L/MSS病例為2.1%、4.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)檢測(cè)了572例患者NRAS第2、3外顯子的突變情況，兩個(gè)外顯子的總突變率分別為1.0%和1.0%，NRAS第2外顯子在MSS/MSI-L組突變率為1.1%，在MSI-H組中未見突變，與之相似，NRAS第3外顯子在大腸癌中突變率也極低，在MSS/ MSI-L組突變率為1.1%，在MSI-H組中未見突變。

本研究檢測(cè)了手術(shù)切除保留完整的557例大腸癌患者的EGFR、MGMT免疫組織化學(xué)表達(dá)情況和473例患者Lgr5的表達(dá)情況，結(jié)果顯示EGFR、MGMT、Lgr5表達(dá)缺失情況在MSI-H和MSS/MSI-L兩組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 RAS突變及MGMT、Lgr5、EGFR免疫組織化學(xué)表達(dá)情況

3 討論

在中國，大腸癌的發(fā)病率和死亡率均在逐年上升，而在西方國家則是逐年降低的。MSI與大腸癌的發(fā)展、預(yù)后、療效、遺傳等均有相關(guān)性［7-14］。

目前，大腸癌男女發(fā)生病例約為1.3：1，本研究結(jié)果顯示MSI-H組和MSS/MSI-L組在大腸癌男女分布比例上無顯著性差異，而在年齡分布中存在顯著性差異，MSS/MSI-L組的大腸癌患者發(fā)病年齡較大，且病灶常位于直腸，而MSI-H組的患者病灶多位于右半結(jié)腸，提示MSI可能參與了右半結(jié)腸癌的發(fā)生過程，提示左、右半結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制在基因水平上可能是不同的，右半結(jié)腸癌的發(fā)生主要是通過復(fù)制錯(cuò)誤引起腫瘤相關(guān)基因的突變，而左半結(jié)腸癌主要通過雜合性缺失引起癌基因和抑癌基因的突變［15］。

同時(shí)本研究也比較了微衛(wèi)星狀態(tài)和部分易造成大腸癌進(jìn)展的危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系，以推測(cè)微衛(wèi)星狀態(tài)對(duì)大腸癌預(yù)后的影響。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為大腸癌的主要轉(zhuǎn)移途徑，本研究結(jié)果提示MSI-H組較MSS/MSI-L組確診分期早，受累淋巴結(jié)較少，且較少形成癌結(jié)節(jié)，上述結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)MSI-H可能為大腸癌預(yù)后較好的因素之一。而對(duì)于另一些危險(xiǎn)因素，如脈管、神經(jīng)受累、分化程度、癌組織是否含有黏液成分、Ki-67及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，兩組間在發(fā)生上未見顯著性差異，明確上述因素與腸癌預(yù)后的具體相關(guān)性，仍需進(jìn)一步研究。

有研究顯示，MSI狀態(tài)對(duì)于抗PD-1免疫治療具有指導(dǎo)意義，MSI-H組和MSS/MSI-L組顯示出與免疫相關(guān)的RECIST客觀反應(yīng)率分別為40%、0，而兩組20周時(shí)免疫相關(guān)無進(jìn)展生存率分別為78%、11%，均具有顯著性差異［16］。另一項(xiàng)正在進(jìn)行的臨床研究CheckMate142在探索接受尼魯單抗聯(lián)合伊匹單抗治療的dMMR/MSI-H mCRC患者PD-L1表達(dá)及生物標(biāo)志物與臨床治療效果的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，存在MSI-H組的患者均能從免疫治療當(dāng)中獲益。2017年美國默沙東公司研發(fā)的抗PD-1抗體KEYTRUDA的上市，也為帶有MSI-H實(shí)體瘤患者的治療帶來了新的方向。而另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)［17］也提出，PD-L1抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑對(duì)于治療MSS/dMMR的患者也存在顯著療效，客觀緩解率和疾病控制率分別為17%和39%?？梢娕R床上微衛(wèi)星狀態(tài)的檢測(cè)能有效的評(píng)估免疫治療在腫瘤治療中的效益。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSI-H多位于右半結(jié)腸，MSS多位于直腸和左半結(jié)腸，提示右半結(jié)腸癌患者更有可能從抗PD-1免疫治療中獲益，而直腸癌患者從PD-L1抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑的治療中獲益較大。

在分子層面上，本研究發(fā)現(xiàn)KRAS突變與MSI-H狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，即KRAS第2外顯子的突變率在MSIH大腸癌中明顯低于MSS/MSI-L大腸癌，這與Lin等［18］的報(bào)道相同。同時(shí)，本課題組［19］的一項(xiàng)關(guān)于KRAS突變和MSI共存狀態(tài)對(duì)中國大腸癌患者預(yù)后相關(guān)性研究中指出，同時(shí)具有KRAS突變和MSI狀態(tài)的大腸癌患者較其他共存狀態(tài)組有較好的預(yù)后，可見KRAS突變和MSI可作為預(yù)測(cè)大腸癌預(yù)后的指標(biāo)聯(lián)合使用。

MGMT為一種由207個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白，用于修復(fù)烷化劑造成的DNA損傷，損傷修復(fù)后則MGMT表達(dá)缺失［20］。有研究表明，MGMT表達(dá)的缺失與MSI的發(fā)生和hMSH2的表達(dá)缺失呈正相關(guān)［21-23］，且替莫唑胺等烷化劑對(duì)MGMT缺失的轉(zhuǎn)移性大腸癌治療效果較好［24-25］，推測(cè)MSI-H組患者較MSS/MSI-L組更易從替莫唑胺治療中獲益。在本研究的免疫組織化學(xué)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)MSI-H組患者中MGMT表達(dá)缺失率高于MSS/MSI-L組（23.7%vs.14.1%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究中MSI-H組發(fā)生率（7.0%）低于其他文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)。Lgr5為一種結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，被證實(shí)與腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［26］。而MSI也是腸癌發(fā)生的一條重要分子途徑，本研究發(fā)現(xiàn)不同微衛(wèi)星狀態(tài)的Lgr5蛋白表達(dá)情況未見顯著性差異，兩條途徑之間是否有交叉相互影響仍需進(jìn)一步探討。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，EGFR在MSI-H組中的陽性表達(dá)率高于MSS/MSI-L組（55.3%vs. 43.7%），而KRAS和NRAS的突變率MSI-H組低于MSS/MSI-L組，推測(cè)在轉(zhuǎn)移性大腸癌中，MSI-H組患者較MSS/MSI-L組更易在抗EGFR的治療中獲益，但這還需更多的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，在大腸癌中微衛(wèi)星狀態(tài)的檢測(cè)對(duì)個(gè)體化免疫治療具有重要意義，不同的微衛(wèi)星狀態(tài)具有其特異性的臨床病理特征，微衛(wèi)星狀態(tài)聯(lián)合其他分子檢測(cè)和免疫組織化學(xué)指標(biāo)對(duì)大腸癌的治療和預(yù)后存在指導(dǎo)作用，同時(shí)減少治療的盲目性，提高M(jìn)SI腫瘤患者的生存期。

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