p57KIP2、cyclin D1、cyclin E在男性乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

羅祖強(qiáng) 莊志泉 董為松 涂曉萌

男性乳腺癌（male breast cancer，MBC）組織學(xué)類型較多，其中以浸潤性導(dǎo)管癌最為常見。目前我國MBC的發(fā)病率約為1/20萬，占全部乳腺癌患者的1%～2%。近年來，由于生活環(huán)境等因素的改變，發(fā)病率有所上升，而發(fā)病機(jī)制至今未明［1］。眾所周知，正常細(xì)胞分裂、復(fù)制是在正常的細(xì)胞周期調(diào)控下完成的，細(xì)胞周期調(diào)控由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）-細(xì)胞周期蛋白（cell cycle protein，cyclin）-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitors，CKI）構(gòu)成。細(xì)胞周期調(diào)控異常，可導(dǎo)致腫瘤的形成。p57KIP2是CKI中的一員，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期的作用。研究顯示，p57KIP2異常表達(dá)是促進(jìn)腫瘤形成的原因之一［2］。cyclin促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S期限制點(diǎn)，加速細(xì)胞的增殖。cyclin D1、cyclin E是cyclin家族中的重要成員。關(guān)于p57KIP2在MBC中的表達(dá)及其與cyclin D1、cyclin E的相互關(guān)系尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討p57KIP2、cyclin D1、cyclin E與MBC的發(fā)病及預(yù)后的關(guān)系，以期為MBC早期診斷及分子靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集2000年1月至2016年12月60例溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院MBC患者的組織標(biāo)本，分為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組（infiltrating ductal carcinoma，IDC）40例、乳腺導(dǎo)管原位癌組（ductal carcinomain situ，DCIS）20例，選取20例男性乳腺發(fā)育癥（gynecomastia，GYM）作為對照組。根據(jù)AJCC癌癥分期手冊（第7版）中的TNM分期［3］，40例IDC分為Ⅰ期10例、Ⅱ期16例、Ⅲ+Ⅳ期14例；根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)（2003年）中的組織學(xué)分級，40例IDC分為Ⅰ級9例、Ⅱ級22例、Ⅲ級9例?；颊吣挲g為30～72歲，中位年齡51歲，術(shù)前均未行放、化療等治療。所有手術(shù)切除標(biāo)本留取部分新鮮標(biāo)本存入液氮中備用，其余標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.1.2 試劑 PCR引物購自上海生工公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京TaKaRa公司，p57KIP2、cyclin D1、cyclin E抗體、EliVision試劑盒及其他試劑均購自福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測 提取細(xì)胞總RNA，檢測p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃15 min，85℃5 s。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色，采用凝膠成像處理系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物電泳條帶積分光密度值進(jìn)行分析，以p57KIP2、cyclin D1和cyclin E的PCR產(chǎn)物測定值與β-actin測定值的比值表示mRNA的相對表達(dá)水平，引物序列見表1。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測 將石蠟4 μm厚連續(xù)切片，EliVision法檢測p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白的表達(dá)。使用陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞核，為棕褐色或棕黃色。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果判斷參考郭娜娜等［4］報(bào)道的方法，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比分為無陽性細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。按著色強(qiáng)度分為無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比積分與著色強(qiáng)度積分相加，0～1分為（－），2分為（+），3～4分為（++），＞5分為（+++），其中（+）～（+++）為陽性、（－）為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測IDC、DCIS及GYM組織中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA的表達(dá)

p57KIP2mRNA表達(dá)水平在三組間及兩兩間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；cyclin D1和cyclin E mRNA表達(dá)水平均在IDC中最高、在GYM中最低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測IDC、DCIS及GYM組織中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白的表達(dá)

p57KIP2蛋白在GYM中表達(dá)最高，在IDC中表達(dá)最低，三組間及兩兩間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1A、B）；cyclin D1和cyclin E蛋白在IDC中表達(dá)最高，在GYM中表達(dá)最低，IDC與GYM、DCIS與GYM比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C、D，表3）。

表1 p57KIP2、cyclin D1、cyclin E引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

表2 RT-PCR檢測p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA在IDC、DCIS及GYM中的表達(dá) （x±s）

表3 免疫組織化學(xué)法檢測p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白在IDC、DCIS及GYM中的表達(dá)

圖1 p57KIP2、cyclin D1和cyclin E蛋白在IDC和GYM中的表達(dá) （EliVision法×200）

2.3 IDC組織中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在IDC組織中p57KIP2蛋白的表達(dá)隨著臨床分期、組織學(xué)分級的增高而逐漸降低（P＜0.05）；cyclin D1、 cyclin E蛋白的表達(dá)隨著臨床分期、組織學(xué)分級的增高而逐漸升高（P＜0.05）。p57KIP2蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組中表達(dá)高，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組中表達(dá)低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

表4 p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白在IDC組織中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表4 p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白在IDC組織中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表4）

2.4 IDC組織中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在IDC中，p57KIP2與cyclin D1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（χ2= 28.571，r=-0.738，P＜0.05）；p57KIP2與cyclin E表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（χ2=25.322，r=-0.546，P＜0.05）；cyclin D1與cyclin E表達(dá)呈正相關(guān)（χ2=8.414，r=0.235，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤形成是多因素、多步驟的過程，是細(xì)胞增殖調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂的結(jié)果。p57KIP2是CIP/KIP家族的成員，1995年由Matsuoka等［5］發(fā)現(xiàn)，位于染色體11p l5.5上，能阻滯細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在p57KIP2基因的異常表達(dá)［6-7］。Guo等［8］研究顯示，p57KIP2mRNA、蛋白在肝癌組織中的表達(dá)比正常肝組織低，下調(diào)肝癌細(xì)胞中p57KIP2基因的表達(dá)，能使腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力增強(qiáng)。Yang等［9］研究顯示，p57KIP2蛋白在女性乳腺癌組織中低表達(dá)，p57KIP2表達(dá)與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在女性乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，p57KIP2也能抑制腫瘤細(xì)胞的無限增殖。本研究結(jié)果顯示，在IDC、DCIS、GYM組織中，p57KIP2mRNA及蛋白的表達(dá)均在GYM中最高，在IDC中最低，三組間及兩兩間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在IDC組織中，p57KIP2蛋白的表達(dá)隨著IDC臨床分期、組織學(xué)分級的增高而逐漸降低（P＜0.05）；p57KIP2蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組中表達(dá)高，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組中表達(dá)低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與其他女性乳腺癌研究中的結(jié)果相似［9-10］。本研究提示，在正常男性乳腺細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄、翻譯兩個水平中存在p57KIP2高表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0期，當(dāng)致癌因子使p57KIP2低表達(dá)時，可能解除了對細(xì)胞生長的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞惡變。因此，p57KIP2蛋白可以作為臨床判斷MBC預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

cyclin D1基因位于11q13，cyclin D1蛋白包含295個氨基酸，cyclin D1與CDK4和CDK6結(jié)合，引起Rb的超磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Ahlin等［11］研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1蛋白高表達(dá)能促進(jìn)女性乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，是乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)之一。cyclin E基因位于19q12～13，cyclin E蛋白包含395個氨基酸，cyclin E與CDK2結(jié)合，在細(xì)胞進(jìn)入S期前顯示出短暫而強(qiáng)烈的酶活性，并引起Rb磷酸化，啟動DNA合成。Lucenay等［12］研究發(fā)現(xiàn)，cyclin E蛋白高表達(dá)促進(jìn)了女性乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，是乳腺癌惡性轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志。目前，已有cyclin D1、cyclin E在女性乳腺癌中表達(dá)的研究，但cyclin D1、cyclin E在男性IDC中的表達(dá)情況尚不清楚。IDC的病因至今未明，研究認(rèn)為可能與細(xì)胞周期調(diào)控紊亂等多種因素有關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，cyclin D1和cyclin E mRNA及蛋白的表達(dá)均在IDC中最高、在GYM中最低，IDC與GYM、DCIS與GYM比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與女性乳腺癌研究中的結(jié)果［11-12］相似。cyclin D1與cyclin E在IDC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），提示正常男性乳腺組織細(xì)胞中，cyclin D1、cyclin E在轉(zhuǎn)錄、翻譯的較低水平表達(dá)是男性乳腺細(xì)胞保持正常沉默狀態(tài)所必須的前提條件，如異常高表達(dá)，則可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。cyclin D1、cyclin E可作為臨床判斷MBC預(yù)后的重要指標(biāo)。

細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤細(xì)胞無限增殖的重要原因。本研究結(jié)果顯示，p57KIP2mRNA及蛋白的表達(dá)在GYM中最高，在IDC中表達(dá)最低，cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白的表達(dá)均在IDC中最高、在GYM中最低，p57KIP2與cyclin D1、p57KIP2與cyclin E呈負(fù)相關(guān)，cyclin D1與cyclin E呈正相關(guān)。本研究提示，在正常男性乳腺組織中p57KIP2高表達(dá)，p57KIP2蛋白結(jié)構(gòu)的氨基端介導(dǎo)對CDK激酶活性的抑制，p57KIP2蛋白通過與cyclin E、cyclin D-CDK4等復(fù)合物結(jié)合，抑制復(fù)合物對Rb蛋白的磷酸化作用，使細(xì)胞周期無法完成由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞停滯在G1期，從而對細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。IDC組織中可能由于p57KIP2基因活性下調(diào)，使p57KIP2蛋白低表達(dá)，cyclin D1和cyclin E基因活性上調(diào)，促進(jìn)cyclin D1、cyclin E蛋白的表達(dá)，削弱了p57KIP2抑制cyclin D1、cyclin E的作用，使細(xì)胞無限增殖。

綜上所述，p57KIP2、cyclin D1、cyclin E可能參與了MBC的發(fā)生發(fā)展過程，聯(lián)合檢測p57KIP2、cyclin D1、cyclin E對進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MBC的發(fā)病機(jī)制及治療提供重要參考。

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