食管鱗癌組織中ABCG2、p16表達(dá)變化及意義

陳曉依，呂洋，劉博，李秀娟，劉軍超，常楚迪

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

食管癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。研究顯示，我國(guó)食管癌發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第5位，病死率占第4位，其最常見的組織學(xué)類型為鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)[1]。目前外科手術(shù)仍為其治療的首選方法，但早期食管癌患者術(shù)后5年總生存率僅30%；手術(shù)治療效果差的原因主要為局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而且術(shù)后患者機(jī)體免疫力低下[2]。ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體家族是人類最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族，其中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白2(ABCG2)是ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G族第2個(gè)成員，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)[3]。p16基因是近年來發(fā)現(xiàn)的繼p53基因之后的又一抑癌基因，又稱為多腫瘤抑制基因,屬于cyclin-CDK復(fù)合物的特異性抑制劑，且為細(xì)胞周期調(diào)控的分子開關(guān)[4]。本研究主要觀察ABCG2、p16在ESCC組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2009年12月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)治療的原發(fā)性ESCC患者136例，均經(jīng)病理檢查確診，男91例、女45例，年齡27～80歲、中位年齡61歲，術(shù)前均未接受過治療。術(shù)中留取ESCC組織。另取性別、年齡相匹配ESCC患者的正常食管黏膜組織(距癌組織>5 cm)37例份作對(duì)照。本研究患者均知情同意，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、P16蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP染色法，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。取石蠟切片，經(jīng)檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓抗原熱修復(fù)，陰性對(duì)照用PBS代替。結(jié)果判定：ABCG2蛋白主要定位于細(xì)胞膜，p16蛋白主要定位于細(xì)胞核，以呈現(xiàn)棕黃色顆粒為細(xì)胞染色陽(yáng)性。高倍鏡下，每樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。陽(yáng)性細(xì)胞百分比<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，≥50%計(jì)3分；著色強(qiáng)度為無色計(jì)0分，灰黃色計(jì)1分，金黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分。將以上兩項(xiàng)評(píng)分相加，<3分為表達(dá)陰性，≥3分為表達(dá)陽(yáng)性[5]。以上均至少由兩名病理醫(yī)師在雙盲條件下觀察。

1.3 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、p16 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。將組織置于液氮中充分研磨，用TRIzol法提取組織細(xì)胞總RNA，參照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和目的基因ABCG2和p16(大連寶生物公司)的擴(kuò)增，以GAPDH(大連寶生物公司)為內(nèi)參。ABCG2引物(280 bp)：上游5′-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3′、下游5′-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3′；p16引物(522 bp)：上游5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′、下游5′-AGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′；GAPDH引物(452 bp)：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑盒(大連寶生物公司)20.0 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，sense primer(10 pmol/μL)0.8 μL，antisense primer(10 pmol/μL)0.8 μL，dH2O 7.0 μL，cDNA模板1 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)：95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.5%(85/136)、24.3%(9/37)，p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為32.4%(44/136)、56.8%(21/37)。與正常食管黏膜組織比較，ESCC組織中ABCG2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高(P<0.05)、p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低(P<0.05)。

2.2 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、p16 mRNA表達(dá)比較 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.76±0.06、0.58±0.04，p16 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.03、0.62±0.05。與正常食管黏膜組織比較，ESCC組織中ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高(P<0.05)、p16 mRNA相對(duì)表達(dá)量低(P<0.05)。

2.3 ABCG2及p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 ABCG2及p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤組織學(xué)分級(jí)無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.4 ESCC組織中ABCG2與p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性 ABCG2與p16蛋白在ESCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.438，P<0.05)。

表1 ABCG2及p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3 討論

近年來，隨著化療藥物及方案的改進(jìn)，食管癌的化學(xué)治療取得了很大的進(jìn)步，但耐藥仍是腫瘤化療的主要難題之一，其對(duì)化療效果和患者預(yù)后有較大影響。多重耐藥的形成與多藥耐藥基因、蛋白的高表達(dá)有密切聯(lián)系[6]。ABCG2又稱乳腺癌耐藥蛋白，是近年來發(fā)現(xiàn)的ABC超家族成員之一，定位在人體染色體4q22中，具有1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)跨膜區(qū)[7]。其主要通過參與泵出細(xì)胞內(nèi)的化療藥物，降低胞內(nèi)藥物含量，引起耐藥[8]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ABCG2在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常食管黏膜組織。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與ESCC患者性別、年齡及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤侵至全層、TNM分期高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者ABCG2的陽(yáng)性率高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中ABCG2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于正常食管黏膜組織，進(jìn)一步提示ABCG2高表達(dá)可能與ESCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

p16是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，由148個(gè)氨基酸構(gòu)成，位于9號(hào)染色體短臂21～22區(qū)(9p21～22)，編碼產(chǎn)物為含有4個(gè)獨(dú)特的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)。p16在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)生突變、缺失及甲基化導(dǎo)致失活，最終引起腫瘤的發(fā)生[9]。Mathew等[10]研究顯示，p16的缺失與ESCC病理分期及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于食管正常黏膜組織。這說明與惡性黑色素瘤、尿路上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺腺癌和透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤類似，p16在ESCC組織中的表達(dá)低于其在正常黏膜組織中的表達(dá)[11]。另外，腫瘤侵至全層、TNM分期高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者p16的陽(yáng)性率低，這與趙醒等[12]的研究結(jié)果一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中p16 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于正常食管黏膜組織，以上結(jié)果均說明p16基因的低表達(dá)可能與ESCC的惡性程度有關(guān)。相關(guān)分析顯示，ABCG2與p16在ESCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明二者在ESCC的發(fā)生發(fā)展過程中可能協(xié)同作用，共同影響腫瘤的進(jìn)展。

綜上所述，ABCG2和p16在ESCC組織中的異常表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究?jī)烧叩谋磉_(dá)情況有助于ESCC的輔助診斷及指導(dǎo)治療。

[1] 陳萬青，鄭榮壽，張思維．2012年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國(guó)腫瘤，2016，25(1):1-8.

[2] Song Y, Li L, Ou Y, et al. Identification of genomic alterations in oesophageal squamous cell cancer[J]. Nature, 2014,509: 91-95.

[3] Lagergren J, Lagergren P. Oesophageal cancer[J]. BMJ, 2010,341(261):c6280.

[4] 姚堯，鄒揚(yáng).Bmi-1、p16基因與實(shí)體瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(18)：3162-3164.

[5] 馬大烈,白辰光.免疫組織化學(xué)陽(yáng)性標(biāo)記結(jié)果的觀察和判斷[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2003,19(5):557-559.

[6] 劉亮，左靜，趙麗,等.ABCBl、ABCG2與食管癌患者多藥耐藥的關(guān)系[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2011，31(1):15-17.

[7] Joshi AA, Vaidya SS, St-Pierre MV, et al. Placental ABC transporters: biological impact and pharmaceutical significance[J]. Pharm Res， 2016，33(12)：2847-2878.

[8] Stacy AE， Jansson PJ, Richardson DR．Molecular pharmacology of ABCG2 and its role in chemoresistance[J].Mol Pharmacol, 2013，84(5):655-669.

[9] 劉芳，康雪，劉曉燕,等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織P16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG單位甲基化狀態(tài)檢測(cè)及意義[J].山東醫(yī)藥，2015,55(32)：5-7.

[10] Mathew R, Arora S, Khanna R, et al. Alterations in p53 and pRb pathways and their prognostic significance in oesophageal cancer[J]. Eur Cancer, 2002,38(6):832-841.

[11] Al-Ansari MM， Hendrayani SF， Tulbah A， et al．p16INK4A represses breast stromal fibroblasts migration /invasion and their VEGF-A-dependent promotion of angiogenesis through Akt inhibition[J]. Neoplasia, 2012,14(12):1269-1277.

[12] 趙醒，趙宇陽(yáng)，王軍,等.食管鱗狀細(xì)胞癌中細(xì)胞周期素D1和P16蛋白的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015,36(2):273-276.