ONECUT1重組質(zhì)粒構(gòu)建及其對細胞應激相關(guān)基因表達的影響

余緒明，余世榮，張曉燕，石金敏，王佳

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000)

同源域蛋白在細胞分化和胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用[1]。Cut同源域蛋白是一個特殊的且由兩部分組成的DNA結(jié)合同源蛋白。Cut同源域蛋白根據(jù)Cut重復單元分為幾個亞族[2]。ONECUT屬于Cut同源域蛋白家族的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含1個Cut域和1個同源域。Cut域主要由70個氨基酸組成，主要負責DNA結(jié)合[3]。ONECUT1是ONECUT亞家族中重要成員之一，其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控關(guān)鍵靶基因的表達，此外還調(diào)節(jié)復雜的信號網(wǎng)絡(luò)并介導復雜的生物學進程[4]。機體內(nèi)氧化應激失衡導致活性氧(ROS)過度產(chǎn)生，進而引起組織損傷。此外，氧化應激失衡也是某些疾病發(fā)生的誘因之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ONECUT1可能是線粒體抗氧化酶系統(tǒng)若干基因的上游調(diào)控基因，在調(diào)節(jié)線粒體抗氧化應激反應中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。但ONECUT1與應激之間的相關(guān)性尚缺乏系統(tǒng)研究。為進一步探究其生物學功能，2017年3～7月，本研究構(gòu)建了人源ONECUT1-pcDNA3.1(-)表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染U251細胞，檢測細胞應激相關(guān)基因的表達，以期為闡明ONECUT1與抗氧化應激基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激基因的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑來源 U251細胞由武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院汪暉教授實驗室提供；AxyPrep質(zhì)粒DNA小劑量試劑盒購自AxyGEN；FBS購自杭州四季青公司；DMEM購自武漢啟動子生物公司；Penicillin-Streptomycin Solution, 100X購自CORNING；opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；TRIzol購自TAKARA；DH5α感受態(tài)購自TIANGEN；yeast extrac、Tryptone購自Invitrogen；Ampicillin soidium購自AMRESCO；T4DNA連接酶、EcoRⅠ、HindⅢ購自Invitrogen公司；pcDNA3.1(-)購自湖南優(yōu)寶生物公司；DNA Ladder購自碧云天生物公司；Agarose購自Sigma；SYBR Premix EX Taq購自TAKARA；I-5TM 2X Hi Fidelity Master Mix購自Molecular Cloning Laboratones；All-in-one cDNA Synthesis SuperMix購自Biotool；GoldViewⅡ型核酸染色劑購自Solarbio；膠回收試劑盒購自BiomiGA。

1.2 U251細胞培養(yǎng) 自液氮罐中取出U251細胞，迅速置于37 ℃水浴中解凍1～2 min，加入含10% FBS、1%雙抗培養(yǎng)液10 mL，1 500 r/min離心5 min棄培養(yǎng)基，將細胞接種于培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當細胞呈單層致密狀分布時，PBS洗1～2遍，0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3傳代，傳至第2代用于實驗。

1.3 h-ONECUT1質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI給出的ONECUT1 mRNA參考序列(NM_004498.3)設(shè)計構(gòu)建PCR擴增的上下游引物，即上游引物序列為AATGGAATTCATGAACGCGCAGCTGACCATGG (內(nèi)切酶為EcoRⅠ)，下游序列為GGCGAAGCTTTCATGCTTTGGTACAAGTGCTTG(內(nèi)切酶為HindⅢ)。提取U251細胞總RNA，取1 μg總RNA，加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix 10 μL，RT-PCR擴增獲得cDNA樣本，擴增條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA樣本為模板，用構(gòu)建的上下游引物RT-PCR擴增ONECUT1全部CDS序列。構(gòu)建體系：cDNA模板3 μL、Froward primer 2 μL、Reverse primer 2 μL、I-5TM， 2×High Fidelity Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL；條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳，目的基因切膠回收并用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后T4DNA連接酶連接過夜，DH5α感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，AMP板子上挑選單克隆并搖菌擴增，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒進行雙酶切、RT-PCR鑒定，并進行測序。

1.4 h-ONECUT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將U251細胞接種于6孔板，約(1～2)×105/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞長至40%～60%時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipo2000轉(zhuǎn)染說明書進行操作。體外采用opti-MEI優(yōu)化培養(yǎng)基分別稀釋重組h-ONECUT1-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒和pcDNA3.1(-)質(zhì)粒各4 μg作為A液，將Lipo2000 10 μL加入opti-MEI優(yōu)化培養(yǎng)基250 μL中作為B液，均室溫放置5 min，將A液加入B液混勻，室溫放置20 min，即體外重組質(zhì)粒包裝完成。將包裝好的重組質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染組)及空載質(zhì)粒(空載組)分別加入6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。qRT-PCR法檢測顯示，U251細胞內(nèi)ONECUT1升高，轉(zhuǎn)染成功。

1.5 U251細胞ONECUT1、線粒體抗氧化應激相關(guān)基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因表達檢測 采用qRT-PCR法。轉(zhuǎn)染24 h收集細胞，TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA樣本，-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR檢測h-ONECUT1；線粒體抗氧化應激相關(guān)基因包括SOD1、CAT、GPX1、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、NRF2、KEAP1、PARK7；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因包括MANF、PERK、IRE1α和ATF6。引物由武漢擎科生物公司合成，引物序列：ONECUT1上游引物5′AGCGTCGAACTCTACATGCAA3′，下游引物5′TGCTTTGGTACAAGTGCTTGAT3′；Nqo1上游引物5′GAAGAGCACTGATCGTACTGGC3′，下游引物5′GGATACTGAAAGTTCGCAGGG3′；GcLm上游引物5′CATTTACAGCCTTACTGGGAGG3′，下游引物5′ATGCAGTCAAATCTGGTGGCA3′； prdx1上游引物5′CCACGGAGATCATTGCTTTCA3′，下游引物5′AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT3′；GcLc上游引物5′GGAGACCAGAGTATGGGAGTT3′，下游引物5′CCGGCGTTTTCGCATGTTG3′；sirt1上游引物5′TGTGTCATAGGTTAGGTGGTGA3′，下游引物5′AGCCAATTCTTTTTGTGTTCGTG3′；CAT上游引物5′CTTCTCCAGTGGCCAGACATG3′，下游引物5′GTCATCAGGGCAAACCTCCTT3′；GPX1上游引物5′TGACTCTACCCACGGCAAGTTCAA3′，下游引物5′ACGACATACTCAGCACCAGCATCA3′；SOD1上游引物5′GAAGAGGTTCTGTGGGGTTT3′，下游引物5′CCTGACTGATATATGTGGCTC3′；NRF2上游引物5′TCCAGTCAGAAACCAGTGGAT3′，下游引物5′GAATGTCTGCGCCAAAAGCTG3′；KEAP1上游引物5′GTGTCCATTGAGGGTATCCACC3′，下游引物5′GCTCAGCGAAGTTGGCGAT3′；PARK7上游引物5′AACCGGAAGGGCCTGATAG3′，下游引物5′GCAAGAGGGTGTGTTGTAACT3′；MANF上游引物5′GCTACTATATCGGGGCCACAG3′，下游引物5′CTTCTTCAGGTCCACTGTGCT3′；PERK上游引物5′GGAAACGAGAGCCGGATTTATT3′，下游引物5′ACTATGTCCATTATGGCAGCTTC3′；IRE1α上游引物5′AGAGAAGCAGCAGACTTTGTC3′，下游引物5′GTTTTGGTGTCGTACATGGTGA3′；ATF6上游引物5′TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA3′，下游引物5′CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG3′；GAPDH上游引物5′CATCACCATCTTCCAGGAGCGAGA3′，下游引物5′TGCAGGAGGCATTGCTGATGATCT3′。擴增體系：Template 2 μL，SYBR Green Mix 5 μL，primer F 0.3 μL，primer R 0.3 μL，dd H2O 2.4 μL；條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 h-ONECUT1質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在DNA Marker 1 000～1 500 bp出現(xiàn)單帶，即為插入的全部CDS序列，1 398 bp。測序證實質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 兩組細胞內(nèi)線粒體抗氧化應激相關(guān)基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因表達比較 與空載組比較，轉(zhuǎn)染組線粒體抗氧化應激相關(guān)基因CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7表達上調(diào)(P均<0.05)，SOD1、GPX1、NRF2、KEAP1表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與空載組比較，轉(zhuǎn)染組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因MANF、IRE1α、PERK、ATF6表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1、2。

表1 兩組線粒體抗氧化應激相關(guān)基因表達比較

表2 兩組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因表達比較

3 討論

ONECUT家族包含哺乳動物肝核因子6(HNF6)[6]、人源OC-2[7]、果蠅D-onecut[8]及海鞘類HrHNF-6[9]。人源ONECUT1主要位于15號染色體上，具有6個外顯子，編碼含有465個殘基的蛋白；其大多分布于肝臟、大腦、皮膚組織中[10]，在腦中表達存在區(qū)域特異性;進一步研究發(fā)現(xiàn)，其利用雙向ONECUT同源域序列將蛋白定位于核腔室，并與許多靶基因啟動子的特異性DNA序列結(jié)合，進而調(diào)控靶基因的表達[4]。本研究探討了ONECUT1與應激之間的相關(guān)性，利用重組DNA技術(shù)成功敲高U251細胞內(nèi)ONECUT1。SOD1、CAT、GPX1、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、NRF2、KEAP1、PARK7是體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)重要的代表性基因，重要功能之一是維持機體內(nèi)線粒體氧化應激穩(wěn)態(tài)[11]。CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7可能是ONECUT1的下游靶基因。ONECUT1可能具有抗線粒體氧化應激的功能。MANF是進化上高度保守的分泌型分子，大多數(shù)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。MANF是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應蛋白，可快速分泌并保護細胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的死亡。PERK、IRE1α、ATF6均是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜敏感蛋白，參與非折疊蛋白反應；在正常細胞中，三者通過結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要伴侶分子GRP78/Bip，維持著失活狀態(tài)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，GRP78從敏感蛋白中分離，隨后三者被活化。本研究轉(zhuǎn)染后U251細胞內(nèi)線粒體抗氧化應激相關(guān)基因CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7表達上調(diào)，SOD1、GPX1、NRF2、KEAP1表達無變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因MANF、IRE1α、PERK、ATF6表達無變化。提示ONECUT1可能是抗線粒體氧化應激基因，在調(diào)節(jié)線粒體氧化應激穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用；ONECUT1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激無關(guān)，ONECUT1在體內(nèi)可能不參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應[12]。

本課題組后續(xù)研究擬采用RNAi干擾技術(shù)，敲低U251細胞內(nèi)ONECUT1，檢測細胞內(nèi)CAT、PRDX1、SIRT1、NQO1、GcLm、GcLc、PARK7的表達。以期進一步闡明ONECUT1的抗線粒體氧化應激的生物學功能。

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