腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)患者血漿miRNA特異性表達譜篩選

晉力，曾仲，劉濤

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650000)

目前腎移植已成為治療終末期腎病的有效手段，但術(shù)后排斥反應(yīng)仍然是引起慢性腎功能不全(CRAD)的重要因素，其中急性排斥反應(yīng)(AR)被認(rèn)為是引起CRAD主要免疫性危險因素。microRNA(miRNA)是一類在人體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，通常由18～22個核苷酸組成。目前研究證據(jù)表明miRNA參與調(diào)控超過60%的人類編碼基因[1]，許多miRNA隨著免疫細(xì)胞的生長和激活而發(fā)生動態(tài)變化，其在先天性及獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用[2]。研究證明，miRNA與多種疾病病理相關(guān)，如移植腎排斥反應(yīng)[3]及纖維化[4]等。本研究利用高通量miRNA芯片檢測技術(shù)，篩選出腎移植AR患者血漿miRNA的特異性表達譜，并采用獨立樣本通過RT-qPCR技術(shù)對芯片結(jié)果進行驗證，以期尋找血漿中可穩(wěn)定檢測到的、與腎移植AR發(fā)生密切相關(guān)的miRNA，作為診斷AR的新型生物學(xué)標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院器官移植科2014年3月～2015年5月首次行同種異體供腎移植術(shù)的患者26例，其中男17例、女9例，年齡19～51歲、平均32.9歲，群體反應(yīng)性抗體<10%，原發(fā)性腎小球腎炎導(dǎo)致的慢性腎衰竭19例、糖尿病腎病6例、高血壓腎小動脈硬化1例；供受體血型均相配，細(xì)胞淋巴毒試驗陰性；均服用免疫抑制劑他克莫司、嗎替麥考酚酯和強的松。其中AR 13例，納入標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)尿量減少、血壓升高、發(fā)熱、體質(zhì)量增加、移植腎區(qū)脹痛等臨床癥狀；血清肌酐水平升高15%以上，尿蛋白增多，彩色多普勒提示血管阻力指數(shù)升高；移植腎活檢，按Banff 97標(biāo)準(zhǔn)診斷；抗移植排斥治療后臨床癥狀改善。非AR 13例，納入標(biāo)準(zhǔn)：無排斥反應(yīng)癥狀，肌酐波動<10%，接受程序性移植腎穿刺活檢，且病理結(jié)果正常。選取同期本院體檢中心體檢健康者10例，男6例、女4例，年齡21～45歲、平均32.7歲。AR患者、非AR患者、體檢健康者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 采集研究對象空腹肘靜脈血4 mL，裝入涂有乙二胺四乙酸二鉀的采血管中，用移液器將血液樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP中，4 ℃、1 700 r/min離心10 min，取上清液置于1.5 mL的EP管中，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取血漿置于1.5 mL的EP管中，-80 ℃保存待用。以上過程于4 h內(nèi)完成。

1.3 miRNA標(biāo)記物篩選 采用微陣列芯片技術(shù)。隨機選取3份AR患者及3份非AR患者的血漿，采用TRIzol法提取血漿總RNA，RNA純度A260/A280≥1.80，表明提取的RNA中蛋白或其他有機物的污染在可接受范圍內(nèi)；另各樣本總量≥1 μg，表明樣本均滿足實驗要求。按照miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Agilent)試劑盒說明書進行操作，芯片掃描結(jié)果整體背景較低，信號強度較強，且信號點大小近乎均一，表明芯片雜交結(jié)果理想。用Agilent Feature Extraction(v10.7)及Agilent GeneSpring 軟件提取與分析數(shù)據(jù)，檢測AR與非AR患者血漿miRNA的表達譜。計算兩組樣品miRNA表達的差異倍數(shù)(FC)，F(xiàn)C正值表明AR患者血漿miRNA比非AR患者表達高，負(fù)值表明AR患者血漿miRNA比非AR患者表達低。差異miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)：FC值>2。

1.4 miRNA臨床驗證 根據(jù)miRNA標(biāo)記物篩選結(jié)果，選擇表達顯著上調(diào)的3種miRNA：miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p作為PCR實驗階段所檢測的目標(biāo)miRNA。提取剩余的10份AR患者、10份非AR患者及10份體檢健康者的血漿總RNA，按Qiagen公司的miRNaesy Mini Kit(Cat No./ID 217004)說明書進行操作。根據(jù)在miR Base數(shù)據(jù)庫中獲得的3個目標(biāo)miRNA的成熟序列設(shè)計3條引物：1條通用的下游引物(GR)、1條特異性上游引物(AS)、1條特異性逆轉(zhuǎn)錄引物(RT)。并使用U6作為內(nèi)參。miR-142-5p的3條引物分別為:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′(GR)、5′-CGGGCATAAAGTAGAAAGCAC-3′(AS)、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACagtagt-3′ (RT)；miR-144-5p的3條引物分別為:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′(GR)、5′-CGGGCGGATATCATCATATACTG-3′(AS)、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcttaca-3′(RT)；miR-130a-3p的3條引物分別為:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3(GR)、5′-CGGCAGTGCAATGTTAAAAGG-3′(AS)、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACatgccc-3′(RT)；內(nèi)參U6的2條引物分別為:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(F)、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(R)。按Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)試劑盒說明書使用莖環(huán)法對3個目標(biāo)miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以第1鏈cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系：模板1 μL、Syber Green Master 6 μL、特異性上游引物1 μL、通用的下游引物1 μL、RNase-Free water 3 μL；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行50～55個循環(huán)；4 ℃/s勻速升溫至95 ℃后恒溫15 s；4 ℃/s勻速降溫至60 ℃后恒溫1 min；4 ℃/s勻速升溫至95 ℃后恒溫15 s；在最后步驟中每升溫1 ℃采集1次熒光信號繪制熔解曲線。用U6作為內(nèi)參照，使用軟件直接得到各樣本中has-miR-142-5p、has-miR-144-5p及has-miR-130a-3p的循環(huán)數(shù)值(Ct值)。用2-ΔΔCt法計算各miRNA的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 AR患者與非AR患者miRNA表達譜比較 AR患者與非AR患者共檢測出96個差異表達的miRNA，其中13個(13.5%)表達上調(diào)(P<0.05)、7個(7.3%)表達下調(diào)(P均<0.05)。見表1。

表1 AR患者與非AR患者miRNA表達譜比較

2.2 miRNA表達譜臨床驗證結(jié)果 AR患者血漿miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p相比表達量均高于非AR患者、體檢健康者(P均<0.05)，非AR患者、體檢健康者血漿miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p相比表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 AR患者、非AR患者、體檢健康者血漿miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p表達比較

3 討論

AR是影響移植腎長期存活的主要因素之一，早期診斷并及時治療AR可有效降低移植腎的病理損害程度，并延長其存活時間。移植腎急性排斥反應(yīng)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為腎穿刺病理檢查，但為有創(chuàng)檢查，且可能需多次穿刺才能符合AR的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；同時受抽樣誤差、病理醫(yī)師水平等因素的影響，均可增加誤診風(fēng)險[5,6]。因此，臨床迫切需要具有高度敏感性及特異性，可穩(wěn)定檢測的、與腎移植AR密切相關(guān)的指標(biāo)，作為診斷AR的新型生物學(xué)標(biāo)記物。

近年來，研究表明miRNA與腎移植術(shù)后AR的發(fā)生密切相關(guān)。Sui等[7]通過比較3例AR患者腎活檢樣本與3例正常腎皮質(zhì)樣本之間的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)AR組中有8種miRNA表達上調(diào)，12種miRNA表達下調(diào)。Anglicheau等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AR患者有7種miRNA表達上調(diào)，10種表達下調(diào)。以上研究均采用腎臟組織作為芯片檢測樣本，這與從患者血液或尿液中無創(chuàng)檢測出目標(biāo)miRNA存在一定差異。Lorenzen等[3]用實時定量PCR技術(shù)，分別檢測了AR組與非AR組患者尿液中miR-10a、miR-10b及miR-210的表達，結(jié)果顯示AR組相比非AR組，其miR-10a表達上調(diào)，而miR-10b及miR-210表達下調(diào)。劉小友等[9]獲取了12例腎移植術(shù)后發(fā)生AR患者及21例未發(fā)生AR患者的血液樣本，AR組外周血中miR-223表達升高，并在術(shù)后一直維持高表達狀態(tài)，且靈敏度為0.92、特異度為0.90。該研究同樣檢測了外周血單個核細(xì)胞在激活與非激活狀態(tài)下的miR-223表達，結(jié)果顯示激活組中miR-223的表達增加3.76倍。本研究通過獲取被檢人群的血漿作為試驗樣本，利用芯片及PCR技術(shù)，比較miRNA的表達。結(jié)果顯示，腎移植AR組與非AR組之間共檢測出96個差異表達的miRNA，其中20個miRNA表達差異顯著，13個表達上調(diào)，7個表達下調(diào)。以上表達差異的miRNA可作為進一步篩選AR發(fā)生的依據(jù)。進一步采用獨立樣本，對芯片檢測結(jié)果中表達上調(diào)的3個目標(biāo)miRNA進行PCR定量檢測，結(jié)果顯示相比非AR組及正常對照組，AR組中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p的表達上調(diào)，這與芯片結(jié)果相一致。提示以上3個miRNA可能與腎移植術(shù)后AR的發(fā)生有關(guān)。

研究表明miR-142-5p不僅在腎移植AR患者的活檢標(biāo)本中高表達，在其他病理過程中也有高表達的情況發(fā)生，如腫瘤、免疫相關(guān)障礙、小腸炎等。Anglicheau等[8]研究認(rèn)為腎移植AR患者移植腎活檢組織中miR-142-5p的表達上調(diào)，可能與淋巴細(xì)胞的直接浸潤相關(guān)?？紤]到造血細(xì)胞系中存在的大量miR-142-5p[10,11]，推測miRNA可能是由淋巴細(xì)胞攜帶進入異體移植物，從而影響局部炎癥反應(yīng)。另有研究認(rèn)為，異體移植物本身可誘導(dǎo)發(fā)生一系列阻止排斥反應(yīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)過程，但在調(diào)節(jié)的同時仍有排斥反應(yīng)在發(fā)生，可能是由于異體抗原的持續(xù)暴露[12]。

Su等[13]指出miRNA主要調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，但其在巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的纖維化中的作用還不明確；在巨噬細(xì)胞內(nèi)，IL-4及IL-13共同誘導(dǎo)miR-142-5p及miR-130a-3p表達上調(diào)，以維持巨噬細(xì)胞的纖維化；同時指出miR-142-5p及miR-130a-3p可在慢性炎癥中調(diào)控巨噬細(xì)胞纖維化相關(guān)基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，AR患者中miR-142-5p及miR-130a-3p表達上調(diào)，推測相關(guān)miRNA可能通過提高移植腎內(nèi)炎癥因子的表達，增加巨噬細(xì)胞的趨化性，以影響腎移植AR微環(huán)境的炎癥反應(yīng)。另外，Ouyang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在三陰乳腺癌組織中miR-130a-3p及miR-451a表達下調(diào)，提示miR-130a-3p還可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。

Matsushita等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細(xì)胞中miR-144-5p的表達下調(diào)，并顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且直接調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控基因CCNE1、CCNE2及CDC25A的表達。在乳腺癌患者外周血單核細(xì)胞中，miR-144-5p表達上調(diào)，miR-144-5p可作為預(yù)測乳腺癌發(fā)生的潛在非侵入性生物學(xué)標(biāo)記物，但對于腎移植AR則無相關(guān)報道。

排斥反應(yīng)是移植后腎功能異常的主要影響因素，從術(shù)后4 d至10年都有可能發(fā)生AR。術(shù)后5年內(nèi)，在發(fā)生移植腎功能異常的受者中，AR占據(jù)了很大的比例。有統(tǒng)計顯示，在程序性移植腎穿刺時，AR患者的肌酐水平較高，但在施加干預(yù)措施后，其肌酐水平明顯下降，1年后移植腎功能喪失比例較低，相反在腎穿刺時慢性排斥反應(yīng)患者的肌酐水平較低，但穿刺活檢后1年移植腎功能喪失比例較高，且預(yù)后較差。以上表明，AR如能早發(fā)現(xiàn)、早治療，可以逆轉(zhuǎn)，且能取得良好的治療效果。

本研究用高通量miRNA芯片檢測技術(shù)，篩選腎移植AR患者血漿中miRNA的特異性表達譜；并用獨立樣本通過定量PCR技術(shù)驗證芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后患者血漿中miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p表達上調(diào)，這可能與移植腎急性排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其各自在移植腎排斥反應(yīng)中的作用值得進一步研究。AR患者與非AR患者檢測出差異表達的miRNA，為今后研究其在腎移植AR發(fā)生中的作用機制提供依據(jù)。

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