SLE合并SONFH患者血清差異表達(dá)蛋白篩查

賴崇榮，曾平，劉雄，陳金龍，范思奇，秦剛，周怡，廖小波，何凱毅，劉明偉，周艷瓊，黃碧秋

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3廣西醫(yī)科大學(xué))

目前，激素性股骨頭壞死(SONFH)確切的發(fā)病機(jī)制仍未徹底闡明，其早期診斷與治療仍然缺乏特異的生物學(xué)標(biāo)志物，是骨科領(lǐng)域的常見疑難疾病[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為SONFH疾病機(jī)制的闡明、早期診斷與治療提供了理論依據(jù)及解決方法。目前，SONFH的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚處在起步階段，使用類固醇皮質(zhì)激素(GC)后發(fā)生SONFH的蛋白質(zhì)組學(xué)研究鮮有報(bào)道。本研究以血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)作為切入點(diǎn)，以SLE合并SONFH患者作為研究對象，采用同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(TMT)聯(lián)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D-LC-MS/MS)，篩查用于闡明SONFH發(fā)病機(jī)制的血清特異性蛋白標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年4月～2016年6月廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床收治的SLE合并SONFH患者10例(SONFH組)，均為女性，年齡(43.50±7.32)歲，國際骨循環(huán)學(xué)會分期Ⅱ期2例、Ⅲ期3例、Ⅳ期5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；符合SONFH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；滿足GC的服用條件及服用總量(3個(gè)月內(nèi))≥2 000 mg強(qiáng)的松、連續(xù)服用時(shí)間≥1個(gè)半月[4]。另選健康志愿者5例作為對照組，均為女性，年齡(42.00±6.16)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。

1.2 血清樣品采集 清晨抽取兩組空腹肘靜脈血10 mL，置于枸櫞酸鈉采血管，于4 ℃冰箱放置1～2 h，3 000 g 離心 10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清差異表達(dá)蛋白篩查 蛋白提取及酶解：按照 ProteoExtracrTM試劑盒操作說明書去除血清中的高豐度蛋白，洗脫液加入5倍體積丙酮，-20 ℃沉淀3 h，離心后晾干蛋白沉淀塊，加入適量Resolution Buffer復(fù)溶血清蛋白。用Bradford法測定蛋白濃度。取蛋白樣品100 μg，用8 mol/L Urea buffer調(diào)整體積。加入終濃度10 mmol/L二硫蘇糖醇于37 ℃孵育45 min，再加入終濃度25 mmol/L碘乙酰胺室溫避光孵育55 min，用三乙胺-碳酸緩沖溶液(TEAB)稀釋Urea后進(jìn)行酶解。根據(jù)質(zhì)量比1∶50加入trypsine，37 ℃酶解過夜，再次按質(zhì)量比1∶100加入trypsine，37 ℃二次酶解4 h。采用TMT聯(lián)合2D-LC-MS/MS進(jìn)行檢測。肽段標(biāo)記：Strata X C18(Waters公司提供)對酶解后的蛋白樣品進(jìn)行脫鹽處理，按照TMT Kit Protocol對肽段進(jìn)行標(biāo)記。將除鹽后的肽段溶于100 mmol/L TEAB，乙腈41 μL溶解TMT試劑(0.8 mg)，并與肽段100 μg合并后室溫反應(yīng)1 h，加入羥胺終止標(biāo)記反應(yīng)，合并各組樣品后真空干燥。肽段組分分離：分別將兩組標(biāo)記肽段使用Waters HPLC e2695/2998色譜儀(Waters公司)，用高pH C18 RP色譜柱(Thermo公司)進(jìn)行餾分分離。待收集的肽段流出組分后，真空抽干，合并成8個(gè)組分，分別將每個(gè)組分溶于nanoLC A 液20 μL，進(jìn)樣2 μL，經(jīng)上樣柱上樣后通過分析柱梯度洗脫，用Orbitrap Elite組合式質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。用Proteome Discoverer 1.3(Thermo Scientific)軟件將Orbitrap Elite對肽段鑒定的原始圖譜文件(.raw文件)轉(zhuǎn)化為.mgf文件，用MASCOT2.3.0服務(wù)器于數(shù)據(jù)庫中檢索。通過MASCOT服務(wù)器上形成的查庫文件，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.01的標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。以兩組血清蛋白差異倍數(shù)>1.20為蛋白表達(dá)上調(diào)，<0.83為蛋白表達(dá)下調(diào)。

1.4 生物信息學(xué)分析 通過Uniprot數(shù)據(jù)庫中的注釋信息鑒定篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)，選擇GO的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能注釋對蛋白進(jìn)行分類和富集分析；利用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。用雙樣本等方差假設(shè)對兩組蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行雙尾t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白篩查結(jié)果 與對照組比較，SONFH組共鑒定出差異表達(dá)血清蛋白16種。其中免疫球蛋白重鏈1(IGHV1OR15-1)、銅藍(lán)蛋白(CP)、α1-酸性糖蛋白(ORM1)、補(bǔ)體C9(C9)、IGHG1蛋白、C反應(yīng)蛋白(CRP)、結(jié)合珠蛋白(HP)表達(dá)上調(diào)。SERPINA4蛋白、凝溶膠蛋白(GSN)、凝血因子Ⅻ(F12)、色素上皮細(xì)胞衍生因子(SERPINF1)、備解素(CFP)、巰基氧化酶1(QSOX1)、凝血因子ⅩⅢ(F13A1)、KRTDAP蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)表達(dá)下調(diào)。

2.2 差異表達(dá)蛋白GO功能注釋聚類分析結(jié)果 生物過程方面發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要參與了單一生物過程、細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、生物過程的調(diào)控、代謝過程、生物過程的負(fù)調(diào)控、多細(xì)胞生物過程、生物過程的正調(diào)控、細(xì)胞定位、多生物過程、發(fā)育過程、免疫系統(tǒng)過程、信號傳導(dǎo)、生長過程、細(xì)胞成分組織、細(xì)胞定位、節(jié)律過程、生物黏附。分子功能方面發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要涉及結(jié)合、催化活性、分子功能的調(diào)節(jié)、抗氧化活性。細(xì)胞構(gòu)成方面差異蛋白主要定位于胞外區(qū)、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物組分、膜蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞連接等部位。

2.3 差異蛋白KEGG通路注釋聚類分析結(jié)果 見表1。

表1 差異蛋白參與的信號通路

3 討論

迄今為止，SONFH的發(fā)病機(jī)制尚不明確。國內(nèi)外研究者從分子、基因水平對SONFH發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，提出了多種學(xué)說，如脂質(zhì)代謝紊亂、血液凝溶、氧化應(yīng)激反應(yīng)、微血管損傷、細(xì)胞凋亡學(xué)說等[5]；但只針對某一病因，大多涉及1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子、酶、基因等，而疾病的發(fā)生發(fā)展可能是多種因素的結(jié)果，目前尚無一種學(xué)說能夠全面闡明其發(fā)病機(jī)制。本研究應(yīng)用TMT聯(lián)合2D-LC-MS/MS技術(shù)檢測，篩選出SONFH組與對照組有差異的蛋白16個(gè)，通過KEGG通路注釋進(jìn)一步提取到與8個(gè)差異蛋白相關(guān)的12條KEGG信號/代謝通路。差異蛋白主要集中在補(bǔ)體與凝血級聯(lián)反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、p53信號通路、卟啉和葉綠素代謝、FcγR-介導(dǎo)吞噬等，說明血液凝溶系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、脂代謝及基因多態(tài)性與SONFH的發(fā)病密切相關(guān)。

血液高凝狀態(tài)被認(rèn)為是SONFH的關(guān)鍵性發(fā)病因素，F(xiàn)12、F13A1在機(jī)體血液凝溶系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。F12是血管生成的生理性調(diào)節(jié)因子，抑制凝固過程的發(fā)展，激活凝血酶活化纖溶抑制物，抑制纖維蛋白溶解，可在血管損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Raghu等[6]指出F13A1表達(dá)異常，引發(fā)機(jī)體高凝狀態(tài)，增加了SONFH的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，SONFH組與對照組比較，F(xiàn)12、F13A1表達(dá)下調(diào)，并富集至補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)信號通路。CP作為血清中一種具有氧化酶活性的α2-糖蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞生長、誘導(dǎo)血管生成或新血管形成的生理作用。王偉等[7]研究表明，在類風(fēng)濕患者中，CP表達(dá)的高低與類風(fēng)濕因子呈正相關(guān)，可見CP與類風(fēng)濕密切相關(guān)；但其在SONFH發(fā)病機(jī)制所起的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，SONFH組與對照組相比，CP蛋白表達(dá)上調(diào)，并富集至卟啉和葉綠素代謝信號通路。提示SONFH患者股骨頭的壞死塌陷及隨后出現(xiàn)的修復(fù)反應(yīng)，血管的生成可能處于一種活躍狀態(tài)。股骨頭壞死與修復(fù)不是完全分開而是同時(shí)交織進(jìn)行，因此推測F12、F13A1、CP可能在股骨頭壞死與修復(fù)過程中發(fā)揮誘導(dǎo)新血管形成的作用。本研究認(rèn)為F12、F13A1、CP可能是SONFH的特異性蛋白標(biāo)志物。

免疫系統(tǒng)蛋白表達(dá)與SONFH發(fā)病機(jī)制緊密相關(guān)，補(bǔ)體系統(tǒng)在組織重塑過程中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和壞死的重要作用。C9具有防止免疫復(fù)合物沉著、活化補(bǔ)體的作用。Cuadrado等[8]認(rèn)為，在SLE等自身免疫性疾病中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的抗磷脂抗體能引起血栓，使患者處于骨壞死高危狀態(tài)，激素的應(yīng)用則增加了自身免疫性疾病骨壞死的發(fā)病率。本研究也觀察到免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白在SONFH血清中的表達(dá)上調(diào)，并富集至補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、朊病毒疾病、阿米巴病四條信號通路，提示免疫反應(yīng)可能涉及該病的發(fā)病過程，這些蛋白有可能涉及補(bǔ)體的激活。HP作為一種血漿糖蛋白，具有能與紅細(xì)胞外血紅蛋白結(jié)合構(gòu)成非共價(jià)復(fù)合物的生理功能，當(dāng)機(jī)體介導(dǎo)炎癥時(shí)其血漿中的含量升高[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，SONFH組與對照組比較，C9、HP表達(dá)上調(diào)，提示SONFH患者可能因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)紊亂，加重了壞死組織損傷并阻滯骨組織的修復(fù)。基于此，推測C9、HP可能是SONFH的特異性蛋白標(biāo)志物。GSN是一種肌動蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放、炎性細(xì)胞的凋亡以及炎性介質(zhì)的清除等，對炎癥反應(yīng)發(fā)展與轉(zhuǎn)歸有極其重要影響。Hu等[10]對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與SLE患者的GSN進(jìn)行測定，結(jié)果提示GSN可能對SLE的診斷和活動度判斷有重要價(jià)值。Wu等[11]通過血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ONFH患者中GSN水平較對照組下降，提出GSN參與了體內(nèi)的各種有害反應(yīng)，但GSN在ONFH中的生物學(xué)作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，SONFH組與對照組比較，GSN下調(diào)，并富集至肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、FcγR-介導(dǎo)吞噬、病毒致癌這3條信號通路上，反映其在SONFH中發(fā)生的各種有害反應(yīng)，包括細(xì)胞凋亡、組織壞死或骨壞死以及血管退化。推測GSN極其可能是SONFH的特異性蛋白標(biāo)志物。

脂質(zhì)代謝紊亂是SONFH的主要病理表現(xiàn)。脂肪因子在脂質(zhì)代謝過程中起著重要作用，PEDF是脂肪來源的分泌性糖蛋白，通過甘油三酯脂肪酶來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[12]。孫少松等[13]發(fā)現(xiàn)，PEDF可明顯提高成骨細(xì)胞的遷移能力，抑制成脂主要調(diào)節(jié)因子PPARγ-2的表達(dá)，上調(diào)成骨標(biāo)志因子Runx2的表達(dá)，有效促進(jìn)成骨細(xì)胞向成骨分化及礦化，從而改善成骨細(xì)胞的功能。本研究中，SONFH組與對照組相比，PEDF表達(dá)下調(diào)，顯示SONFH患者存在骨代謝水平的改變，其成骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。因此本研究認(rèn)為PEDF可能是SONFH的特異性蛋白標(biāo)志物，提示SONFH患者存在脂質(zhì)代謝異常及氧化應(yīng)激水平的改變。SONFH患者長時(shí)間服用GC，可能導(dǎo)致機(jī)體血管脂肪栓塞、血脂升高、骨細(xì)胞脂質(zhì)代謝功能障礙，從而進(jìn)一步降低了股骨頭骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化能力，甚至直接誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞而發(fā)生骨壞死，進(jìn)而誘發(fā)ONFH。

基因遺傳多態(tài)性與SONFH發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。IGFBPs家族具有調(diào)節(jié)骨代謝及其相關(guān)疾病的作用不斷得到實(shí)驗(yàn)研究與臨床觀察的證實(shí)，但其基因多態(tài)性與SONFH的關(guān)系一直未見報(bào)道。研究表明，IGFBP3與股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Hong等[14]在2010年應(yīng)用基因芯片分型技術(shù)發(fā)現(xiàn)，IGFBP3基因rs2453839突變位點(diǎn)與ANFH發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)，首次闡述IGFBP3基因多態(tài)性與ONFH發(fā)病關(guān)聯(lián)。季志英等[15]發(fā)現(xiàn)，早熟患兒血清IGF-1水平升高而IGFBP3水平降低，表明早熟患者成骨細(xì)胞的刺激因子、血清中軟骨細(xì)胞分裂增殖水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)SONFH組IGFBP3表達(dá)下調(diào)，并富集至p53信號通路、在癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)，可能證實(shí)IGFBP3基因多態(tài)性與SONFH存在高度相關(guān)性，為進(jìn)一步進(jìn)行該基因相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，也為臨床SONFH的分子水平防治，提出了監(jiān)控的主要分子靶標(biāo)之一。

綜上所述，本研究應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，應(yīng)用TMT聯(lián)合2D-LC-MS/MS技術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)，篩查出F12、F13A1、CP、HP、補(bǔ)體C9、GSN、PEDF、IGFBP3等與SONFH相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，極可能是SONFH潛在的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。以上蛋白涉及與SONFH發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的血液凝溶系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、脂類代謝及基因多態(tài)性，但其在SONFH發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未完全清楚，需進(jìn)一步研究評價(jià)其可靠性。

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