復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織梗死體積及形態(tài)學影響的實驗研究*

凌 麗 沈俊逸 陳 淼 方邦江

（1.上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京，210002；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；4.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

腦梗死具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點，一直是國內外研究的重點與熱點。糖尿病是腦梗死的重要獨立危險因素，糖尿病患者腦梗死發(fā)病率比普通人群高2～6倍［1-2］。糖尿病并發(fā)腦梗死是糖尿病最常見的血管合并癥，占糖尿病合并腦血管病變的88%以上［3］，可能與糖尿病代謝紊亂、血液高凝狀態(tài)、微血管病變等因素有關。臨床應用復元醒腦湯治療糖尿病腦梗死取得了良好的療效。為了進一步探討復元醒腦湯治療糖尿病腦梗死機制，本實驗擬在建立糖尿病腦梗死大鼠模型的基礎上，觀測復元醒腦湯對其腦組織梗死體積、腦組織病理形態(tài)學改變的干預作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠，雌雄各半，22月齡，體質量（200±）g，SPF級，共 150只，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于張江復旦藥學院動物房。

1.2 試藥與儀器 鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；TTC 染色液（2%）、戊二醛固定液（2.5%），上海遠慕生物科技有限公司；4%多聚甲醛，上海復申生物科技有限公司；蘇木精染液、伊紅染液，上海國藥集團化學試劑公司；高脂飼料，上海仕林生物科技有限公司；電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；歐姆龍血糖儀HGM-114，歐姆龍健康醫(yī)療（中國）有限公司；MCAO栓線，北京西濃科技有限公司；大鼠腦立體定位儀，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；-80℃冰箱DW-86L388A，中國海爾；冷凍離心機FC5515R，奧豪斯儀器（上海）有限公司；石蠟包埋機，德國Leica；BX51光學顯微鏡，日本Olympus。實驗藥物：復元醒腦湯［人參10 g（單煎），生天南星 15 g，石菖蒲 12 g，三七 10 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，制大黃 10 g（后下）］，由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院制劑室生產提供，濃度為388 g生藥／L。鹽酸二甲雙胍緩釋片，規(guī)格：0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司。尼莫地平片，規(guī)格：20 mg/片，正大青春寶藥業(yè)有限公司。

1.3 造模與分組 健康SD大鼠，共150只，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，在常規(guī)適應性分籠喂養(yǎng)4 d后隨機分為正常組30只與糖尿病模型組120只，糖尿病組采用STZ腹腔注射法制備糖尿病模型［4-5］。糖尿病模型造模成功后，連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2周，高脂飼料成分：60%常規(guī)飼料+15%蔗糖+15%豬油+5%全脂奶粉+5%蛋黃。再將糖尿病模型組按每組均等例數(shù)隨機分為糖尿病腦梗死假手術組（假手術組）、糖尿病腦梗死模型組（模型組）、糖尿病腦梗死西藥治療組（西藥治療組）和糖尿病腦梗死中藥治療組（中藥治療組）4組。糖尿病腦梗死大鼠模型采用線栓法制備［6-7］，假手術組除不插入線栓外，余手術步驟同糖尿病腦梗死組。完成造模后，中藥治療組給以復元醒腦湯10.4 g/（kg·d）灌胃，西藥治療組以二甲雙胍27 mg/（kg·d）、尼莫地平2.16 mg/（kg·d）灌胃（參照陳奇主編《中藥藥理實驗方法學》依實驗動物與人體表面積比計算），正常組、假手術組、模型組均給以等容量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，各實驗組每天的灌胃量均分為2次完成，連續(xù)灌胃14 d后處死取材。

1.4 標本采集與檢測 1）腦梗死體積測定。造模結束后每組各取7只大鼠進行TTC染色測定出梗死體積。10%水合氯醛溶液0.3～0.35 mL/100 g腹腔內注射深度麻醉后，快速斷頭冰上取腦，剪開皮膚暴露頭及頸段，從頸椎處剪斷脊髓，剝離頸部肌肉，用止血鉗剔除顱骨，去除硬腦膜，從小腦處向上推起腦組織，剪斷腦神經，取出完整的腦組織。將腦組織置于-20℃的冰箱中速凍20 min，由前極向后用大鼠腦立體定位儀行冠狀切片，每片厚2 mm，一般切成5～6片。切片置于含0.05%TTC的濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，37 ℃溫水浴避光孵育 15～30 min，每間隔5 min輕柔晃動平皿。然后將TTC液倒出，在PBS液中洗3次，每次1 min。最后放入4%的多聚甲醛溶液中固定。正常組織被染成紅色，梗死區(qū)域為蒼白色。采用圖像分析軟件通過色彩分割等方法對薄層掃描儀掃出的圖像進行分析，由同一名操作者在盲法狀態(tài)下計算各實驗組腦梗死體積（像素數(shù)）。2）腦組織病理形態(tài)學觀察。造模結束后每組各取3只大鼠進行HE染色、2只大鼠進行透射電鏡檢查以觀察腦組織病理形態(tài)學改變。HE染色：每組各取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后，迅速開胸暴露心臟，左心室插入灌注針頭至主動脈根部，剪開右心耳；灌注0.9%氯化鈉注射液約200 mL，時間約4～5 min；待流出血液逐漸變淺，肝臟、眼珠也逐漸變白，接著用4%多聚甲醛約300 mL快速灌注固定約30 min，觀察大鼠的身體反應，尾巴豎起，四肢伸直變硬。依前法開顱取腦，放入4%多聚甲醛中，固定時間約為4～6 h，在4℃冰箱中固定。經梯度酒精序列脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切成厚4 μm切片、烤片、脫蠟、脫水、HE染色、脫水、透明、封片、光鏡下拍照觀察腦組織病理形態(tài)學改變。3）透射電鏡下觀察腦皮質微血管。每組各取2只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后，置冰上迅速斷頭取腦，沿視交叉處前后1 mm切開，在缺血梗死周圍皮質取大約1 mm3（1 mm×1 mm×1 mm）組織，置入4℃ 2.5%戊二醛固定液中約2 h，配制0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次并固定2 h或更長時間，4℃保存，移入1%鋨酸固定液中固定2～3小 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次。經脫水、包埋、固化、超薄切片機50～60 nm切片、3%醋酸鈾-枸櫞酸鋁雙染色、透射電鏡觀察并拍片。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SAS9.3統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 入組情況 見表1。共150只大鼠，分為5組，每組30只。正常組中有2只因死亡退出實驗，另外120只大鼠中有20只糖尿病未成模，余100只平均分為4組，每組25只。假手術組、模型組、西藥治療組、中藥治療組分別有2只、10只、9只、7只因死亡退出實驗。因此各組入組數(shù)據(jù)分別為正常組28只、假手術組23只、模型組15只、西藥治療組16只、中藥治療組18只。每組取7只大鼠經TTC染色測定腦組織梗死體積；每組取3只大鼠進行HE染色、2只大鼠通過透射電鏡觀察腦組織病理形態(tài)學改變；余大鼠做其余指標的檢測。

表1 大鼠造模后入組情況統(tǒng)計（n）

2.2 腦梗死體積測定 見圖1～圖2和表2。采用TTC染色法［8-9］測定計算腦組織梗死體積，正常組織被染成紅色，梗死區(qū)域為蒼白色。從TTC染色圖片中可見正常組和假手術組大鼠的腦組織無梗死灶，模型組、西藥治療組和中藥治療組均有明顯的腦梗死病灶，梗死范圍主要位于額葉、頂葉、部分顳葉皮質、背側丘腦、內囊和紋狀體等大腦中動脈支配區(qū)域，其中西藥治療組和中藥治療組腦組織的梗死范圍均較模型組有所減小。西藥治療組梗死體顯著低于模型組（P＜0.01），中藥治療組梗死體積亦顯著低于模型組（P＜0.01），西藥治療組與中藥治療組在減小腦梗體積方面無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖片

圖2 各組大鼠缺血腦組織的梗死體積

表2 各實驗組大鼠缺血腦組織的梗死體積比較（±s）

表2 各實驗組大鼠缺血腦組織的梗死體積比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。下同。

組 別 n 梗死體積正常組 7 0.00假手術組 7 0.00模型組 7 169.110±11.980*西藥治療組 7 140.580±12.826△中藥治療組 7 132.721±8.994△

2.3 腦組織病理形態(tài)學觀察 見圖3～圖6。HE染色（圖3）見正常組細胞排列整齊，結構完整，細胞核居中，數(shù)量較多，染色較深，細胞質的染色較均勻，未出現(xiàn)細胞變性和壞死現(xiàn)象。假手術組細胞結構有輕微損傷，出現(xiàn)了細胞核固縮現(xiàn)象，細胞質的染色欠均勻。模型組細胞結構模糊，細胞之間的間隙增大，排列紊亂，細胞核固縮、破裂甚至消失，胞漿染色不均勻，有明顯的細胞變性和壞死。西藥治療組和中藥治療組的腦梗死組織結構得到改善，細胞排列趨向于規(guī)則、有序、清晰，細胞核固縮和彌散現(xiàn)象減弱，胞漿染色較模型組均勻，體積膨大的細胞數(shù)量減少，細胞損傷明顯得到改善。

圖3 各組大鼠腦組織HE染色圖片（400倍）

圖4 各組大鼠腦皮質微血管（Bar值為2 μm）

圖5 各組大鼠腦皮質神經元細胞核（Bar值為2 μm）

圖6 各組大鼠腦組織神經元髓鞘（Bar值為2 μm）

透射電鏡（圖4、圖5、圖6）可以觀察到正常組腦皮質微血管的血管壁厚，電鏡下染色深，血管內皮細胞之間緊密連接，基底膜緊密連接；神經元細胞核大而圓，染色均勻，表面光滑。胞內可見基本正常的線粒體，線粒體呈桿狀，橢圓形，結構完整，形態(tài)均勻，分布有序；白質中髓鞘電鏡下染色較深，大小相對一致，形態(tài)層次分明。假手術組腦皮質微血管的管徑出現(xiàn)增粗，管壁相對較薄，血管內皮細胞增大，其緊密連接微量變化，基底膜疏松；神經元細胞核開始出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，染色不均一，表面相對光滑，細胞核周圍可以觀察到溶酶體的存在，線粒體數(shù)量減少，明顯腫脹；白質中髓鞘排列漸變紊亂，形態(tài)出現(xiàn)層次分離，但沒有明顯的脫髓鞘現(xiàn)象。模型組血管形狀不規(guī)則出現(xiàn)變形，細胞壁染色淺，甚至破損。血管內皮細胞的胞質嚴重水腫，胞核彌散，緊密連接斷裂不規(guī)則，基底膜疏松；神經元細胞核嚴重彌散，染色不均一，細胞核周圍可以觀察到溶酶體的存在，線粒體數(shù)量減少，破壞嚴重，核糖體等細胞器也破壞明顯；白質中髓鞘排列嚴重紊亂，脫髓鞘現(xiàn)象明顯。西藥治療組及中藥治療組與模型組相比管壁相對增粗，血管內皮細胞的胞質水腫減輕，胞核彌散減輕，緊密連接逐漸恢復規(guī)則化，基底膜疏松減弱；神經元細胞核彌散現(xiàn)象減弱，染色比較均一，表面相對光滑，核膜結構完整，部分線粒體空化，線粒體損傷較模型組明顯減輕；白質中髓鞘損傷得到一定的修復，層次清晰化，染色漸深，脫髓鞘現(xiàn)象得到明顯改善。

3 討 論

隨著我國膳食結構的西方化和人口老齡化，以及人口基數(shù)的不斷增加，糖尿病腦梗死患病率和患病的絕對人數(shù)還將不斷攀升［10-12］。積極探索和深入研究糖尿病腦梗死的發(fā)病機制與有效防治方法，是一項具有重要社會意義和科學意義的醫(yī)學課題。

糖尿病并發(fā)腦梗死，屬中醫(yī)學“消渴病中風”病范疇，其理論淵源最早可追溯到《黃帝內經》中。有關糖尿病腦梗死的中醫(yī)病機一般認為氣陰兩虛、瘀阻脈絡居多［13］，痰瘀互結、痰熱生風為病機核心。 《素問·上古天真論》云“女子七七”“男子八八”“天癸絕”，腎元虧虛，形神俱傷，可為中風的發(fā)病基礎，正如元代沈金鏊提出“元氣虛為中風之根也”，痰、瘀為元氣虛所導致的中間病理產物，又為新的病理過程啟動之因，痰瘀互阻，氣血痹阻或者日久化火生風，風火相煽，遂發(fā)“中風”。復元醒腦湯以扶持元氣為主，佐以逐瘀化痰、泄熱熄風、通絡為輔，治療糖尿病腦梗死取得良好臨床療效。方中人參大補元氣為君，補脾益肺，脾氣健運，肺氣宣暢，則痰濁自消，為扶正祛邪，治本之藥；石菖蒲與膽南星均為祛痰要藥，石菖蒲功擅豁痰辟穢、開竅寧神，膽南星力偏清熱化痰，息風定驚，兩者合用可治療痰濕與風邪交阻腦竅之癥；三七活血化瘀，大黃通腑瀉下，清熱解毒，兼具活血化瘀之功，與三七合用一通一澀，止血不留瘀，且能通過通腑達到滌痰瀉濁之功；水蛭活血化瘀、消癥破結，近人張錫純氏認為本品“破瘀血而不傷新血，專入血分而不損氣分”，為化瘀峻品；益母草為血家圣藥，尤善解郁平肝、活血祛風，諸藥合用，方小力專，起“復元醒腦、逐瘀化痰、泄熱息風”之功。

既往諸多實驗研究表明：中藥可以縮小局灶性腦缺血后大鼠腦組織梗死體積，促進腦梗死周圍區(qū)的血管新生，改善腦缺血后神經功能恢復［9，14-15］。 本實驗結果顯示正常組和假手術組未出現(xiàn)梗死灶，但假手術組腦組織形態(tài)學出現(xiàn)了輕微的病理改變，細胞出現(xiàn)了輕微的損傷，腦組織微血管超微結構開始發(fā)生改變。模型組和治療組均有明顯的梗死灶及形態(tài)學改變，其中西藥治療組和中藥治療組的梗死范圍和腦組織病理形態(tài)學改變均較模型組有所改善，中藥治療組相較于西藥治療組，在縮小腦梗范圍方面無統(tǒng)計學差別。復元醒腦湯能明顯縮小腦組織梗死體積，改善組織結構和細胞損傷，逐漸恢復腦內毛細血管內皮細胞之間的緊密連接，改善神經元的損傷，進而改善神經缺損功能，達到治療糖尿病腦梗死的目的。

復元醒腦湯能明顯縮小腦組織梗死體積，但神經功能缺失評分與腦梗死體積的相關性還有待深入研究，已有的研究存在著觀察持續(xù)時間較短［16］、采用的神經功能評分方法不全面的問題［17］。近年來，越來越多的研究將視角轉向神經元及其軸突、膠質細胞和血腦屏障（BBB）等組成的復合體——神經血管單元（NVU）［18］。神經血管單元各組分正常的信號轉導、相互作用組成協(xié)調統(tǒng)一的整體，維護著血-腦屏障的穩(wěn)定。神經元一直被視為中樞神經系統(tǒng)中最重要的細胞，其損傷、功能失調甚至死亡將直接導致神經功能的缺失。神經元和微血管的聯(lián)系不僅僅是血流的調節(jié)，還與血-腦屏障的通透性有關。BBB是NVU的核心結構，由腦微血管內皮細胞、基底膜基質、周細胞、星形膠質細胞足突等組成。微血管內皮細胞既是缺血性損傷的靶點，也是缺血性損傷的平臺，作為腦微血管的特殊結構，還有復雜的內分泌、代謝功能，與多種細胞組織、器官相互聯(lián)系，腦血管內皮細胞還可以通過分泌腦源性神經因子的方式，使神經元免受缺血、缺氧和應激等損害［19］。NVU與缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展關系密切。缺血時血管系統(tǒng)與神經組織之間相互損傷，NVU的完整性和功能的全面性被破壞，神經元、膠質細胞和血管內皮之間的損傷存在相互促進的關系，NVU中任何組分的損傷都會波及其他組分［20］。卒中后，血管的新生對患者的恢復非常重要，治療性血管新生是目前研究的熱點與難點，然而，血管新生并不是血管內皮細胞獨立發(fā)揮作用，而是NVU多種細胞間相互作用的整合；血管新生與神經再生、突觸重塑等多種修復機制密切互補。復元醒腦湯能明顯改善缺血腦組織的組織結構與細胞損傷，改善腦內毛細血管內皮細胞與神經元的損傷，這種針對缺血損傷中神經血管單元中的各組成成分，進行多途徑、多方位的治療，可能是該方有效治療糖尿病腦梗死的原因，其具體的機制尚有待進一步探討。

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