2017國(guó)際工作犬訓(xùn)練使用與育種技術(shù)培訓(xùn)班動(dòng)物克隆技術(shù)外專講學(xué)綜述

萬九生 金永勛

2017年12月15日，根據(jù)國(guó)家外專局引智計(jì)劃，受公安部五局委托，由中國(guó)工作犬管理協(xié)會(huì)主辦的“2017國(guó)際工作犬訓(xùn)練使用與育種技術(shù)培訓(xùn)班”在上海成功舉行。公安部五局程克千處長(zhǎng)到會(huì)并做講話，來自全國(guó)公安各有關(guān)單位、軍隊(duì)、武警、鐵路、消防、海關(guān)、保安和民間等工作犬系統(tǒng)和社會(huì)團(tuán)體的230余名從事工作犬訓(xùn)練、使用、繁育的技術(shù)人員和管理人員參加了此次培訓(xùn)。

本次會(huì)議特別邀請(qǐng)到了在生物技術(shù)領(lǐng)域里的世界級(jí)科學(xué)家、世界克隆犬之父-黃禹錫教授。黃禹錫教授是一個(gè)在生物技術(shù)領(lǐng)域里的世界級(jí)科學(xué)家，2005年世界首次克隆了第一頭克隆犬“Snuppy”，也創(chuàng)建了世界上唯一提供商業(yè)犬類克隆的機(jī)構(gòu)秀巖生命工程研究院。第一頭克隆犬面世之后很多國(guó)家邀請(qǐng)黃教授給他們克隆特殊工作犬，至今他的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)克隆出了800多頭克隆犬。黃禹錫專家就其自身的發(fā)展歷程、利用克隆犬等尖端科學(xué)技術(shù)迅速培育及改良工作犬的技術(shù)、動(dòng)物克隆技術(shù)研究進(jìn)展等專題，通過理論剖析與現(xiàn)場(chǎng)視頻教學(xué)，做了深入細(xì)致的講學(xué)，其主要內(nèi)容及觀點(diǎn)體會(huì)綜述如下。

一、克隆犬之父-黃禹錫的發(fā)展歷程及成果

被譽(yù)為“克隆犬之父”的黃禹錫（Hwang Woo-suk）教授重點(diǎn)介紹了2005年從首爾大學(xué)出來，2006年7月牽頭創(chuàng)辦秀巖生物工程研究院。該院是動(dòng)物克隆、胚胎干細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因等先進(jìn)生物技術(shù)應(yīng)用與生物工程和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?yàn)橹黝}的一個(gè)非營(yíng)利機(jī)構(gòu)，也是黃禹錫教授為中心的科研機(jī)構(gòu)。作為秀巖研究院首席技術(shù)官，黃教授帶領(lǐng)他的科研團(tuán)隊(duì)已創(chuàng)造出了多項(xiàng)世界第一：1999年在世界上首次培育成體細(xì)胞克隆牛；2002年培育出了克隆豬；2003年又首次在世界上培育出“抗瘋牛病?！?；2004年建立世界首例體細(xì)胞核移植人類胚胎干細(xì)胞(NT-1)并且申請(qǐng)專利；2005年成功培育出世界首條克隆犬“Snuppy”； 2009年克隆“911英雄犬”并且轉(zhuǎn)讓給美國(guó)政府；2010年世界首例體細(xì)胞核移植人類胚胎干細(xì)胞(NT-1)獲得歐盟專利；2011年全球首次成功誕生犬科動(dòng)物的異種間動(dòng)物克隆(郊狼誕生)。

近年來，黃教授的科研團(tuán)隊(duì)，主要進(jìn)行研究開發(fā)當(dāng)今科學(xué)界最有潛力的患者特異性胚胎干細(xì)胞，為人類器官移植無菌小型豬，克隆特殊工作犬和寵物犬及克隆瀕臨滅絕動(dòng)物或以滅絕動(dòng)物的復(fù)原等世界矚目科研領(lǐng)域里的研究。最近從世界各國(guó)獲得了世界第一號(hào)人類克隆胚胎干細(xì)胞（NT-1）的國(guó)際專利。在《Nature》等國(guó)際高水平雜志上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文，SCI論文78篇，并被多次引用，獲得10余項(xiàng)世界領(lǐng)先成果和專利。

二、動(dòng)物克隆研究進(jìn)展

黃教授的研究團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)基因和克隆技術(shù)包括犬、豬、牛等方面在全世界頂級(jí)，特別是克隆頂尖的護(hù)衛(wèi)犬，緝毒犬、搜爆犬、導(dǎo)盲犬和賽犬等工作犬，克隆人類疾病模型動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)以及瀕臨滅絕動(dòng)物的研究方面取得了很好的成功。

（一）克隆犬研究

在犬的克隆方面，黃教授帶領(lǐng)的秀巖科研團(tuán)隊(duì)，自2005年克隆犬成功以來，通過多年的不斷探索研究，從千萬次失敗的試驗(yàn)中積累、總結(jié)出其獨(dú)特的經(jīng)驗(yàn)和方法，從而成功建立起一套準(zhǔn)確預(yù)測(cè)母犬排卵時(shí)間和活體取卵的操作技術(shù)，能有效獲得成熟的卵母細(xì)胞用于犬的克隆生產(chǎn)，解決了制約克隆犬生產(chǎn)的最大難題，具備非常強(qiáng)大的科研力量和先進(jìn)成熟的克隆技術(shù)，為韓國(guó)國(guó)家警察機(jī)構(gòu)批量克隆114頭工作犬（搜毒犬、搜爆犬、搜救犬等），以及為美國(guó)、加拿大等34個(gè)國(guó)家地區(qū)克隆出數(shù)百頭優(yōu)秀工作犬，并且將克隆犬廣泛應(yīng)用于實(shí)戰(zhàn)中，表現(xiàn)出了卓越性能。還進(jìn)行了寵物犬克隆的商業(yè)化推廣，獲得了良好的效果。

（1）活體取卵

誘導(dǎo)麻醉和呼吸麻醉相結(jié)合麻醉卵母細(xì)胞供體母犬后，利用高頻電手術(shù)刀沿腹中線開小口，手指插入拉出一側(cè)卵巢，找出輸卵管，通過“沖洗（flushing）”的方式從母犬體內(nèi)收集卵母細(xì)胞。具體的操作方法為：將“沖卵-接卵”裝置（專利保護(hù)）的球形一端由輸卵管在卵巢囊上的開口沿輸卵管走向插入輸卵管中，并用針線對(duì)球形端口在輸卵管上位置進(jìn)行結(jié)扎固定，接著利用留置針將導(dǎo)管引入輸卵管與子宮的連接處，并通過注射器從導(dǎo)管口緩緩注入沖卵液，同時(shí)將經(jīng)輸卵管從“沖卵-接卵”裝置的方形一端流出的沖卵液用小培養(yǎng)皿進(jìn)行收集。一側(cè)輸卵管沖卵完成后，運(yùn)用同樣的操作方法對(duì)另一側(cè)輸卵管進(jìn)行沖洗，沖洗液收集于同一個(gè)小培養(yǎng)皿中。沖卵結(jié)束后進(jìn)行縫合。

（2）卵母細(xì)胞的染色及顯微操作去核

在顯微鏡下對(duì)沖卵液中的卵母細(xì)胞進(jìn)行挑取，一般情況下，1頭發(fā)情母犬經(jīng)沖卵后大約能獲得6～12枚成熟卵母細(xì)胞。隨后利用粗細(xì)不同的挑卵針對(duì)卵丘-卵母細(xì)胞不斷吹打以除去卵母細(xì)胞周圍的多層卵丘細(xì)胞，吹打完成后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至顯微操作間進(jìn)行熒光染色，使胞內(nèi)遺傳物質(zhì)細(xì)胞核染上綠色熒光后，利用顯微操作系統(tǒng)對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作。

（3）供體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中

通過顯微操作系統(tǒng)，吸取待克隆犬的核供體細(xì)胞，依次注入到已去核卵母細(xì)胞中，一個(gè)去核卵母細(xì)胞加一個(gè)核供體細(xì)胞便組成了一個(gè)“核質(zhì)”完整的重構(gòu)胚胎。緊接著對(duì)重構(gòu)胚胎進(jìn)行融合和激活，使其具有繼續(xù)發(fā)育的能力。

（4）代孕母犬及克隆仔犬的護(hù)理與保健

秀巖建有專門的室內(nèi)代孕母犬及克隆犬只飼養(yǎng)與護(hù)理室，室內(nèi)設(shè)若干個(gè)單間犬舍，布局科學(xué)合理，環(huán)境溫馨整潔，并安裝有空調(diào)與犬舍必備的淋浴沖洗等設(shè)備?？寺∨咛ゴ心溉俺跎寺∪痪谧o(hù)理室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)管理，專人精心管理，克隆犬只表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)發(fā)育和行為表現(xiàn)，通過考察可以看出其管理水平很高。

另外，通過培訓(xùn)和交流，我們還獲知了一些與克隆犬相關(guān)的重要技術(shù)和研究方法：①在活體取卵和胚胎移植這2個(gè)環(huán)節(jié)之前，秀巖已通過特定儀器每天對(duì)若干發(fā)情母犬孕酮水平進(jìn)行測(cè)定，從而選擇出2頭排卵時(shí)間相近的母犬分別作為卵母細(xì)胞供體母犬和胚胎移植代孕母犬；②秀巖所使用的供體細(xì)胞大多來源于成體犬腹股溝（大腿根部）約1cm2的皮膚組織，這一位置的采樣能避免對(duì)犬的美觀性造成傷害；③克隆犬研究中所使用的母犬主要來源于韓國(guó)肉用犬農(nóng)場(chǎng)，韓國(guó)有一些大型的肉用犬養(yǎng)殖場(chǎng)可以提供大量的試驗(yàn)用犬，其所用母犬全部為自然發(fā)情的犬只；④準(zhǔn)確測(cè)定母犬的排卵時(shí)間依賴于特定的儀器和經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，這對(duì)于其他研究者將需要花費(fèi)大量的時(shí)間來摸索；⑤活體取卵的成功還有賴于對(duì)“沖卵-接卵”裝置的突破；⑥胚胎移植中，含胚胎培養(yǎng)液的注入量、注入位置、注入速度都有經(jīng)驗(yàn)的凝結(jié)來保證成功率。

（二）克隆瀕危滅絕動(dòng)物(同種或異種間克隆)研究進(jìn)展

在 2011年，黃禹錫教授的研究團(tuán)隊(duì)，全球首次在利用雜種犬為代孕母克隆了七頭稀有的亞洲郊狼的異種間動(dòng)物克隆中取得了成功。異種間動(dòng)物克隆的成功對(duì)今后滅絕動(dòng)物的復(fù)原提供了新的可能性，也在黃禹錫研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行猛犸象復(fù)原課題中起到了啟發(fā)性作用。全球首次異種間郊狼的克隆曾在2012年俄羅斯NTV中被選為世界10大新聞。得到這消息后俄羅斯的東北聯(lián)邦大學(xué)希望與黃教授建立伙伴關(guān)系，一起進(jìn)行一個(gè)叫“重現(xiàn)猛犸象”的項(xiàng)目。大家都認(rèn)為這是一個(gè)令人無法抗拒的想法，而且并不像看起來那么令人驚訝，但在科學(xué)角度來看理論上是可行的。日本的科學(xué)家已經(jīng)用一個(gè)凍存了16年的細(xì)胞，成功克隆出了一只老鼠，證明長(zhǎng)期凍存并不是不可逾越的障礙。關(guān)鍵的是老鼠的細(xì)胞是在穩(wěn)定的狀態(tài)下凍存的。但在猛犸象的個(gè)案中，猛犸象的組織卻經(jīng)歷了多次的冷凍和融化，想找出有活性猛犸象細(xì)胞比海底撈針還難。如果獲得了合適的樣本，我們可以借用跟猛犸象的體積大小最接近的亞洲大象的卵子和代孕母復(fù)原滅絕幾萬年的猛犸象。

三、體會(huì)與值得借鑒之處

通過培訓(xùn)和交流，體會(huì)了韓國(guó)克隆犬技術(shù)的成熟應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范與嚴(yán)謹(jǐn)，克隆犬在韓國(guó)警方的普遍應(yīng)用，開闊了視野，學(xué)到了新技術(shù)、新理念、新方法。

（一）個(gè)人的優(yōu)勢(shì)與崗位的恰當(dāng)配置能促使團(tuán)隊(duì)力量更加強(qiáng)大。秀巖生命工學(xué)研究院儀器設(shè)備先進(jìn)、管理規(guī)范、運(yùn)行井然有序，其研究人員分工明確、各司其職，根據(jù)其自身的專業(yè)特長(zhǎng)專門為克隆研究中的某一環(huán)節(jié)工作，保證克隆每一環(huán)節(jié)的工作都達(dá)到最佳效果，從而保障克隆的成功率。不得不說，在黃教授的團(tuán)隊(duì)中，個(gè)人的技術(shù)優(yōu)勢(shì)與工作崗位的結(jié)合做得非常好，體現(xiàn)在克隆操作中的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)均由相應(yīng)技術(shù)突出的人員來完成，這些人員能將這一環(huán)節(jié)操作技術(shù)發(fā)揮到最佳，這樣環(huán)環(huán)相扣，整個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的克隆實(shí)力必然也異常出色。

（二）研究結(jié)果固然重要，但科學(xué)的探索過程更加可貴。黃教授播放演示的克隆犬關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的視頻，試驗(yàn)操作時(shí)間均為5～10分鐘，而且對(duì)于剖腹手術(shù)做到滴血未出，這些細(xì)節(jié)都是保證手術(shù)成功的重要因素，更加確保了克隆的成功率。我們?cè)隗@嘆、佩服的同時(shí)，更加深刻地認(rèn)識(shí)到從不斷探索到不斷積累這一過程的重要性。黃教授也毫不避諱地提到，秀巖研究團(tuán)隊(duì)今日之所以能在克隆犬領(lǐng)域取得首屈一指的地位與成就，是經(jīng)過十幾年、成千上萬次不斷的嘗試與失敗，才從中摸索積累到可貴的經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)立了當(dāng)今世界領(lǐng)先的克隆犬技術(shù)體系。

（三）科研大環(huán)境的營(yíng)造尤為重要?？蒲写蟓h(huán)境不僅僅是靠幾個(gè)實(shí)驗(yàn)或幾篇論文來營(yíng)造，而更多是一個(gè)體系。在秀巖生命工學(xué)研究院，以黃教授為首席科學(xué)家的科研團(tuán)隊(duì)人員齊整，各有所長(zhǎng)；研究院的硬件設(shè)施先進(jìn)齊備；科研氛圍濃厚，人員大多來自韓國(guó)頂級(jí)的大學(xué)或科研機(jī)構(gòu)，圍繞克隆、干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因技術(shù)做了大量的工作，延續(xù)性非常強(qiáng)，可以花費(fèi)數(shù)年甚至數(shù)十年的時(shí)間和精力全部投入到一個(gè)研究項(xiàng)目中，這對(duì)于國(guó)內(nèi)科研投入普遍重視短期效益提供了借鑒，也對(duì)我們今后的科研如何科學(xué)持續(xù)發(fā)展提供了借鑒。

（四）強(qiáng)化學(xué)術(shù)交流與合作，拓展科研思路和科學(xué)素養(yǎng)。學(xué)術(shù)交流是針對(duì)規(guī)定的課題，由相關(guān)專業(yè)的研究者、學(xué)習(xí)者參加，為了交流知識(shí)、經(jīng)驗(yàn)、成果，共同分析討論解決問題的辦法，而進(jìn)行的探討、論證、研究活動(dòng)。在培訓(xùn)和交流過程中，發(fā)現(xiàn)黃教授團(tuán)隊(duì)非常重視學(xué)術(shù)交流和科研合作，參加國(guó)際會(huì)議或國(guó)際間合作交流非常多，其中與我國(guó)的中科院和北大博雅等就開展了多項(xiàng)合作，并取得了很好的成效。

四、幾點(diǎn)建議

（一）借鑒國(guó)外先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，提高警犬技術(shù)科技含量，增強(qiáng)工作發(fā)展后勁。借鑒和吸收韓國(guó)先進(jìn)的克隆犬技術(shù)，抓好昆明犬克隆技術(shù)研究平臺(tái)等重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，組織和培養(yǎng)科研力量，力爭(zhēng)攻克克隆犬成熟卵母細(xì)胞的活體收集、克隆胚胎移植等技術(shù)難關(guān)，逐步建立工作犬克隆技術(shù)體系，推廣應(yīng)用于工作犬繁育生產(chǎn)中，為一線工作犬實(shí)戰(zhàn)部門裝備量多質(zhì)優(yōu)的警用犬提供技術(shù)支持。

（二）建立全國(guó)功勛警犬體細(xì)胞庫，充分保存和利用頂尖級(jí)警犬資源。通過細(xì)胞冷凍保存技術(shù)，采集全國(guó)被評(píng)為功勛級(jí)警犬的體細(xì)胞，進(jìn)行冷凍長(zhǎng)期保存，建立全國(guó)功勛警犬體細(xì)胞庫，利用克隆犬技術(shù)批量克隆功勛警用犬，可達(dá)到保種和快速提高優(yōu)良警犬的目的，提升警犬技術(shù)的科技含量和服務(wù)公安工作的能力。

（三）堅(jiān)持“走出去，請(qǐng)進(jìn)來”，與韓國(guó)秀巖生命工學(xué)研究院建立長(zhǎng)效交流和合作機(jī)制。此次培訓(xùn)和交流使我們感受到了韓國(guó)克隆犬技術(shù)的先進(jìn)性，推動(dòng)警犬技術(shù)工作的重大作用和商業(yè)化推廣應(yīng)用的價(jià)值，開闊了視野，增進(jìn)了交流，并且中國(guó)工作犬管理協(xié)會(huì)與韓國(guó)秀巖生命工學(xué)研究院黃教授達(dá)成了有關(guān)合作意向。因此，建議多組織和參與國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)合作和交流，拓寬我們?nèi)畼I(yè)科技人員的科學(xué)思路，提高科學(xué)素養(yǎng)，為我國(guó)工作犬事業(yè)的不斷發(fā)展增添新的動(dòng)力。