苧麻BnNRT1.1基因的克隆及表達特性研究

侯美，高鋼，朱愛國，陳平，陳繼康，陳坤梅，熊和平，喻春明

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205）

苧麻（Boehmeria nivea L．Gauld）是蕁麻科苧麻屬多年生草本植物［1］，其蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，生物產(chǎn)量大，再生能力強，是很好的飼用植物蛋白質(zhì)來源［2］，其營養(yǎng)價值與苜蓿（Medicago sativa）相近［3－4］。在正常條件下，硝酸鹽是苧麻從外界吸收的主要氮源，提高苧麻的氮素利用率，便可有效提高苧麻的經(jīng)濟效益。在擬南芥中第一個發(fā)現(xiàn)的硝酸鹽轉運蛋白是硝酸鹽轉運蛋白1.1（nitrate transporter1.1，NRT1.1）［5］，其通過氨基酸序列中第101位蘇氨酸發(fā)生磷酸化修飾而表現(xiàn)出雙親和轉運功能［6］。有研究表明，硝酸鹽在擬南芥中的主要傳感器是NRT1.1［7］。在小麥中發(fā)現(xiàn)經(jīng)氮饑餓處理后TaNRT1.1表達受到顯著抑制［8］；在水稻中發(fā)現(xiàn)NRT1.1B是一個高氮利用率基因，在育種中有著重要的應用價值［9］。另外，在白菜、茶樹、菊花等作物中成功克隆出NRT1.1基因，并對其進行功能鑒定［10－12］。目前關于苧麻對硝酸鹽吸收利用的分子機制研究較少，尚不清楚苧麻硝酸鹽轉運蛋白1.1（BnNRT1.1）在苧麻對氮素吸收利用過程中發(fā)揮的作用。本研究擬通過克隆獲得苧麻BnNRT1.1基因的cDNA全長序列，并對其進行生物信息學分析與表達特性研究，以期為苧麻BnNRT1.1基因的功能研究提供參考，并為提高苧麻氮素利用率奠定分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所苧麻資源圃中龍?zhí)洞舐榕c青皮桿麻兩個苧麻品種為試驗材料（前期試驗發(fā)現(xiàn)龍?zhí)洞舐榈牡曙@著高于青皮桿麻）。

1.2 試驗設計

在中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所苧麻資源圃中取苧麻品種龍?zhí)洞舐榕c青皮桿麻植株，削苗后進行扦插，扦插苗長度約12～15 cm，頂端保留3～4片嫩葉，將削好的扦插苗浸入稀釋500倍的多菌靈中消毒30 s，扦插到Karen牌無土栽培水培儀內(nèi)，置于環(huán)境溫度為25℃、光/暗周期為16/8 h的溫室內(nèi)培養(yǎng)［13］，設計3次生物學重復。先在水培儀中加入10 L自來水，15 d后，將水培儀中的自來水換成10 L氮濃度為9 mmol/L的營養(yǎng)液，其中大量元素基本組成為：Ca（NO3）2·4H2O（472.3 mg/L）、KNO3（505.55 mg/L）、KH2PO4（136.07 mg/L）、MgSO4·7H2O（492.96 mg/L）、CaCl2·2H2O（441.06 mg/L），微量元素配方參考湯滌洛［14］的方法，在處理 0 h、12 h、1 d、3 d、5 d后分別取樣，并將其根、莖、葉分開，液氮速凍后，于－80℃冰箱保存，作為提取總RNA的試驗材料。

1.3 RNA的提取、cDNA第一鏈的合成

取0.1 g苧麻新鮮葉片，利用RNA提取試劑盒（EASYspin Plus Plant RNA Kit，Aidlab biotech）提取苧麻總RNA，具體操作步驟參照北京艾德萊公司的EASYspin Plus Plant RNA Kit說明書，提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop進行質(zhì)量檢測，合格后進行cDNA第一鏈的合成，具體步驟參考cDNA合成試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo）說明書。

1.4 獲取苧麻BnNRT1.1基因全長cDNA序列

利用擬南芥AtNRT1.1基因序列和ncbi－blast－2.5.0＋－win64軟件，與苧麻轉組數(shù)據(jù)庫［15］unigenes序列進行比對，檢索目的序列，通過NCBI對目的序列進行進一步確認，利用oligo7軟件在目的基因ORF區(qū)域兩頭設計引物，BnNRT1.1－F：ATGGCAAGTGGTCTCCCCC，BnNRT1.1－R：GTGACACACAACATCATGAA，擴增苧麻BnNRT1.1全長cDNA序列。以cDNA第一鏈為模板進行擴增，PCR反應條件為：94℃ 3min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃2 min，30個循環(huán)，72℃5 min。反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后，連接到pClone007 Simple載體并轉化大腸桿菌DH5α，在Xgal/IPTG瓊脂糖平板上挑選白色菌落，PCR驗證為陽性菌落后進行測序，由北京擎科生物長沙測序部完成。

1.5 生物信息學數(shù)據(jù)庫與軟件分析

DNA序列的翻譯及分析用DNAMAN進行；基因開放閱讀框用NCBI提供的在線ORFfinder尋找，預測和分析BnNRT1.1基因編碼的產(chǎn)物借助ExPASy在線數(shù)據(jù)庫，理化性質(zhì)采用ProtParam分析軟件預測；親水性/疏水性采用ProtScale預測；苧麻BnNRT1.1蛋白跨膜結構采用TMHMM預測；苧麻BnNRT1.1亞細胞定位及功能分類分別采用PSORT和ProtFun預測；采用NetPhoS 2.0分析苧麻BnNRT1.1蛋白潛在的磷酸化修飾位點；系統(tǒng)發(fā)育樹構建采用MEGA6軟件。

1.6 苧麻BnNRT1.1基因的表達特性研究

利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT－PCR）進行苧麻BnNRT1.1基因的表達特性研究，以苧麻管家基因18S rRNA作為內(nèi)參基因［16］，通過Primer5設計目的基因引物，F(xiàn)（5’－3’）－：AGTTCGACGAGTCGGACAAG，R（5’－3’） －AGATTCCGTAGCCCCAGTCT，反應體系為 5.0μL 2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix，0.2μL 10μmol/L Forward primer，0.2μL 10μmol/L Reverse primer，1μL cDNA，3.6μL dd H2O。反應程序：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，根據(jù)CT值，用公式2-ΔΔCT分別計算出目標基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 樣品RNA質(zhì)量檢測

提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1A所示。可見28S rRNA，18S rRNA和5S rRNA條帶非常清晰，且28S rRNA是18S rRNA的2倍左右。為進一步確定RNA質(zhì)量，使用Naonodrop2000進行濃度檢測，結果顯示所提取 RNA濃度為436.9 ng/μL，A260/A280為2.07，A260/A230為2.06，說明此RNA完整性較好，純度較高，不存在蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)的明顯污染，符合試驗要求，可用于后續(xù)試驗。

2.2 目的片段的PCR擴增與克隆鑒定

以提取的苧麻總RNA為模板，反轉錄成cDNA，用合成的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1B所示。將目的片段回收純化后連接到pClone007 Simple載體并轉化大腸桿菌，對白斑進行PCR菌液鑒定，確定為陽性菌落，如圖1C所示。進行測序后得到BnNRT1.1全長序列1869 bp，其中含開放閱讀框（ORF）1776 bp，其編碼的核苷酸序列與氨基酸序列如圖2所示。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.11%agarose gel electrophoresis

圖2 苧麻BnNRT1.1的核苷酸序列及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of BnNRT1.1

2.3 苧麻BnNRT1.1基因的生物信息學分析

2.3.1 苧麻BnNRT1.1蛋白的氨基酸序列分析

ProtParam預測顯示，苧麻BnNRT1.1基因編碼591個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為65.25 kD，等電點是8.85，理論推導半衰期大于10 h，不穩(wěn)定參數(shù)（Instability index）為31.49，屬穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為98.17，屬脂溶蛋白，總平均親水性為0.325，為疏水性蛋白。ExPASy網(wǎng)站的SPOMA信息庫對該蛋白質(zhì)序列進行二級結構預測，結果顯示苧麻BnNRT1.1蛋白的二級結構以 α－螺旋（alpha helix）、無規(guī)則卷曲（random coil）、延伸鏈（extended strand）、β－轉角（beta turn）為結構元件，分別占41.12%、32.99%、17.26%、8.63%。

2.3.2 苧麻BnNRT1.1蛋白跨膜結構分析

通過軟件TMHMM Server v.2.0對苧麻BnNRT1.1蛋白跨膜結構預測，結果如圖3所示。苧麻BnNRT1.1蛋白具有12個跨膜結構，在第6和第7個跨膜結構域之間存在一個大的親水環(huán)，符合PTR家族跨膜結構特征。

圖3 苧麻BnNRT1.1蛋白的跨膜結構域預測結果Fig.3 Prediction of transmembrane domain of BnNRT1.1 protein in Ramie

2.3.3 苧麻BnNRT1.1蛋白亞細胞定位及功能預測

采用軟件WoLF PSORT II對苧麻BnNRT1.1蛋白進行亞細胞定位預測，結果見表1。苧麻Bn-NRT1.1蛋白主要定位在細胞質(zhì)膜與囊泡中，為膜蛋白。通過Protfun分析軟件預測基因BnNRT1.1編碼產(chǎn)物功能，結果見表2。由表2可知，該蛋白主要具有信號轉導與轉運功能。采用NetPhoS2.0分析苧麻BnNRT1.1蛋白潛在的磷酸化修飾位點，預測顯示苧麻BnNRT1.1蛋白具有9個絲氨酸激酶磷酸化位點、5個蘇氨酸激酶磷酸化位點、1個酪氨酸激酶磷酸化位點。

表1 苧麻BnNRT1.1蛋白亞細胞定位預測結果Tab.1 Subcellular prediction results of BnNRT1.1 of camellia sinensis

表2 BnNRT1.1蛋白的功能預測結果Tab.2 Functional prediction results of BnNRT1.1 protein

2.3.4 系統(tǒng)進化樹的構建

在NCBI中，將苧麻BnNRT1.1進行blast比對，發(fā)現(xiàn)苧麻BnNRT1.1基因序列與櫻桃、白梨、桑樹、梅、草莓、巨桉、桃樹、核桃、木豆的NRT1序列具有較高相似度，其序列相似度均大于70%。通過MEGA6構建系統(tǒng)進化樹，如圖4所示，苧麻與櫻桃、白梨、桑樹在一個分支上，具有同源關系。

圖4 苧麻BnNRT1.1基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of BnNRT1.1 gene in ramie

2.4 苧麻BnNRT1.1基因的表達特性研究

硝酸鹽處理不同時間后，苧麻BnNRT1.1基因在不同品種及不同部位的表達情況如圖5所示。苧麻BnNRT1.1基因在不同部位表達量不同，根中大量表達，葉片中少量表達，莖中極少表達，在處理3 d后，其表達量達到最大值。苧麻BnNRT1.1基因在不同品種中表達量不同，在前期苧麻氮高效品種篩選試驗中發(fā)現(xiàn)龍?zhí)洞舐榈牡曙@著高于青皮桿麻，本試驗研究表明，BnNRT1.1在氮高效品種龍?zhí)洞舐橹械谋磉_量高于氮低效品種青皮桿麻，且在龍?zhí)洞舐橹械淖畲笙鄬Ρ磉_量約為2.63，青皮桿麻中的最大相對表達量約為1.19。

圖5 苧麻BnNRT1.1基因的表達特性Fig.5 Expression characteristics of BnNRT1.1 gene in ramie

3 討論

苧麻為南方重要的經(jīng)濟作物之一，目前作為飼料作物大范圍推廣應用，如何提高其氮素利用率一直是苧麻育種工作的研究重點［17］。硝酸鹽與銨鹽是植物生長所需氮素的主要來源，在自然條件下，硝酸鹽是非固氮植物生長所需的主要氮源，無論外界硝酸鹽濃度高低，NRT1.1均發(fā)揮重要作用，目前在國內(nèi)對苧麻硝酸鹽轉運蛋白的研究未見相關報道。苧麻BnNRT1.1基因的功能與作用機制是否與其它作物中的相同尚不清楚。本研究從苧麻植株中成功克隆出苧麻BnNRT1.1基因，功能預測表明，苧麻BnNRT1.1基因不僅可以轉運硝酸鹽，還可以作為一種信號分子，其對苧麻生長發(fā)育過程的調(diào)控作用，有待于進一步研究與鑒定。

本研究雖然獲得了苧麻BnNRT1.1的cDNA全長序列，但無法獲得其非編碼區(qū)的相關信息，目前苧麻沒有可利用的基因組數(shù)據(jù)。Blast比對結果表明，苧麻BnNRT1.1基因序列與其它植物的NRT1具有較高相似性，系統(tǒng)進化樹表明，其與櫻桃、白梨、桑樹NRT1具有同源關系，因此可借鑒其同源序列的相關信息進行研究，有助于加快提高苧麻氮素利用率的研究進程。

本試驗表達特性研究表明，苧麻BnNRT1.1基因主要在根中表達，而苧麻具有較復雜的根系結構，其由營養(yǎng)根（俗稱蘿卜根）、支根和細根組成［18］，前人研究［19］表明NRT1.1具有調(diào)控植物根系結構的功能，而苧麻BnNRT1.1是否能夠調(diào)控蘿卜根、支根和細根的形成，有待于進一步研究；苧麻氮代謝過程比較復雜，其與多種代謝途徑相關的基因相關聯(lián)，要完全明確其機制，難度較大。本研究發(fā)現(xiàn)苧麻BnNRT1.1在不同品種中的表達量不同，在氮高效品種龍?zhí)洞舐橹斜磉_量高，氮低效品種青皮桿麻中表達量低，因此BnNRT1.1在苧麻氮代謝過程中發(fā)揮重要作用。在后期研究中可嘗試通過分子生物學手段提高BnNRT1.1基因的表達量來提高苧麻的氮素利用率，本研究為其提供了一定的分子生物學基礎。

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